王晓戎，张 薇，徐婧熙，盛红艳，杨 朋，李先伟
（1.安徽中医药高等专科学校，安徽 芜湖 241000；
2.安徽中医药高等专科学校附属芜湖市中医医院，安徽 芜湖 241000；
3.皖南医学院，安徽 芜湖 241002）
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性肠道炎症，是一种以局部溃疡和结肠慢性炎症为主要病理特征的难治性肠道疾病，具有难治愈、易复发等特点［1］。目前治疗UC 的主要药物有5-氨基水杨酸类（如美沙拉嗪等）、类固醇类、免疫抑制剂、生物制剂等［2］。临床和动物实验研究证明，中药、针灸等治疗有利于缓解溃疡性结肠炎的症状，具有疗效可靠、副作用少、复发率低等优势［3-4］。美沙拉嗪（me⁃salazine，MES）是目前治疗UC 的主要药物之一，但有部分患者治疗后效果并不理想，且长期使用对肝肾的毒性作用较大，需要联合其他药物，如甘草泻心汤［5-6］。
目前UC 的发病机制不详，但核转录因子-κB（nu⁃clear factor-kappa B，NF-κB）信号通路活化是导致UC发生炎症反应的主要分子机制［7-8］。有研究表明，Notch1 信号通路的异常表达可导致肠上皮细胞损伤，并抑制肠上皮细胞向杯状细胞分化，而激活Notch1信号通路则可加速肠黏膜上皮细胞的修复，并促进杯状细胞分化［9］。清白汤能有效减轻结肠炎小鼠的肠道炎症和黏膜屏障功能，其机制可能与通过活化Notch1、抑制NF-κB 信号通路介导的炎症级联反应有关［10］。前期动物实验研究发现，芍药汤（shaoyaode⁃coction，SYD）对UC 大鼠具有抗炎作用［11］，基于以上研究背景，本研究以Notch1/NF-κB 信号通路为切入点，探究SYD联合MES治疗UC的作用及机制，为两药联合应用治疗UC提供实验依据。
1.1 动物 雄性SD大鼠60只，体质量200～220 g，购于上海杰思捷实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（沪）2018-0004。自然光照，温度20～30 ℃，湿度55%～65%，正常饮水。大鼠饮食采用高糖高脂饲料加10%白酒，连续喂养4周。
1.2 药品 美沙拉嗪肠溶片（深圳市康哲药业有限公司，国药准字H20171358，批号L20100A，规格：0.5 g/片）；
芍药汤煎剂由白芍30 g、当归8 g、黄连8 g、黄芩8 g、肉桂4 g、槟榔4 g、木香4 g、炙甘草8 g和大黄6 g 组成，中药材由芜湖市中医医院药剂科采购，中药房代煎成浓度为1 g/ml的药液。
1.3 试剂 大鼠TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA 试剂盒和核蛋白提取试剂盒（北京Solarbio 科技有限公司）；
PrimeScript™RT reagent Kit 和TB Green Fast qPCR Mix［宝日医生物技术（北京）有限公司］；
IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB 及Lamin A 抗体（Santa Cruz 公司）；
Notch1 和Notch1 胞内域（Notch1 intracellular do⁃main，NICD）抗体（美国Abcam 公司）；
TNF-α、IL-1β、IL-6 和GAPDH 抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。
2.1 动物分组与造模 60只大鼠随机分为5组：正常组（N 组）、模型组（M 组）、SYD 组、MES 组、SYD +MES组，每组12只。除正常组外，余组参照文献［12］方法，采用5%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶液连续喂养7d 制备UC模型。UC模型制备后SYD组、MES组及SYD+MES组均连续灌胃给药14 d，SYD 组予SYD 20 g/kg，MES组予MES 0.2 g/kg，SYD +MES 组予SYD 20 g/kg+MES 0.2 g/kg，灌胃容量均为20 ml/kg ；
N 组与M 组灌胃给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠。
2.2 大鼠疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分 分别在给药前1 d 及给药后第7 d 及第14 d，分别测定大鼠体质量、观察大鼠大便形状、血便情况，进行DAI评分。评分标准见表1。
表1 DAI评分标准
2.3 标本采集 以3%戊巴比妥钠（45 mg/kg）溶液腹腔注射麻醉大鼠，沿腹部中线迅速剖开腹部，腹主动脉采血5 ml置于抗凝管中，分离血浆用于相关炎症因子表达水平检测。截取结肠标本（自肛门向上到盲肠段），生理盐水冲洗肠腔3 次，滤纸吸干。沿纵轴破开结肠，观察并记录组织学改变，随后取1/2 结肠标本置于4%多聚甲醛中进行固定用于病理检测，剩下的分成2 份，分别装入EP 管并置于液氮中速冻，后保存于-80 ℃冰箱，用于后续指标检测。
2.4 指标检测
2.4.1 结肠黏膜损伤指数（colon mucosa damage index，CMDI）评分 每组各取4 只大鼠，麻醉后取结肠组织进行CMDI评分，评分标准见表2。
表2 CMDI评分标准
2.4.2 HE 染色和组织损伤指数（tissue damage index，TDI）评分 制备5 µm 石蜡切片，行HE 染色，观察结肠组织病理变化并进行TDI评分，评分标准见表3。
表3 TDI评分标准
2.4.3 炎症因子水平检测 按ELISA 试剂盒说明书检测大鼠血浆TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。
2.4.4 基因表达分析 每组各取8 只大鼠，以戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，在无RNA 酶环境下提取一半结肠组织总RNA，测定浓度后将其逆转录成cDNA。用StepOnePlus™Real-Time PCR System 进行qPCR 扩增，PCR 反应条件参照我们前期研究结果［13］。以GAPDH 为内参，统计各组ΔΔCt 值，计算相应RQ 值并进行分析，引物序列见表4。
表4 qPCR引物序列及产物片段
2.4.5 蛋白表达分析 低温条件提取另一半组织细胞浆和细胞核总蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度。参照我们前期的研究结果，采用Western Blot 法检测相关蛋白的表达［13］。相关蛋白一抗浓度分别为Notch-1（1︰1 000）、NICD（1︰500）、p-IκBα（1︰1 000）、IκBα（1︰1 000）、p-NF-κB p65（1︰500）、NF-κB p65（1︰1 000）、NF-κB p65（nucleus）（1︰500）、TNF-α（1︰1 000）、IL-1β（1︰1 000）、IL-6（1︰1 000）、Lamin A（1︰2 000）及GAPDH（1︰2 000），相应二抗浓度（1︰2 000～1︰5 000）。
2.5 统计学方法 采用SPSS 24.0 统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
3.1 各组大鼠DAI 评分比较 N 组大鼠饮食正常，体重或排便无明显变化。M 组大鼠进食减少，体重减轻，出现明显的血便。SYD 组、MES 组和SYD+MES 组给药14 d 后，大鼠饮食和体质量得到恢复，黏液血便明显减少，粪便成形。给药前1 d，与N组比较，M组大鼠DAI评分明显升高（P<0.05）。给药后第7 d和第14 d，与M 组比较，SYD 组、MES 组、SYD+MES 组DAI 评分均有不同程度降低（P<0.05）；
分别与SYD 组及MES组比较，SYD+MES 组DAI 评分进一步降低（P<0.05）。见表5。
表5 各组大鼠DAI评分比较（分，±s）
表5 各组大鼠DAI评分比较（分，±s）
注：与N组比较，①P<0.05；
与M组比较，②P<0.05；
与SYD组比较，③P<0.05；
与MES组比较，④P<0.05
给药后第14 d 0 3.92±0.29①2.58±0.79②1.25±0.62②③0.67±0.32②③④组 别N组M组SYD组MES组SYD+MES组n 12 12 12 12 12给药前1 d 0 3.83±0.39①3.67±0.49 3.58±0.51 3.75±0.62给药后第7 d 0 3.75±0.45①2.83±0.72②1.91±0.90②③1.08±0.50②③④
3.2 各组大鼠CMDI 评分、结肠病理变化及TDI 评分比较 结肠标本大体检查发现：N 组大鼠结肠黏膜光滑，无粘连，黏膜完整，无糜烂或溃疡；
M 组大鼠结肠黏膜充血和水肿，并在病变处发现溃疡；
SYD 组、MES 组和SYD+MES 组给药14 d 后，溃疡愈合，充血和水肿明显减轻。组织病理学检查显示：N组结肠无明显炎症细胞浸润、上皮和肠隐窝结构完整；
M 组结肠可见明显的炎性细胞浸润，隐窝丢失，杯状细胞减少，局灶性溃疡，黏膜层广泛破坏和黏膜下水肿；
与M 组比较，SYD 组、MES 组及SYD+MES组上述结肠病理损伤明显减轻；
分别与SYD 组及MES 组比较，SYD +MES 组结肠病理损伤程度进一步减轻。见图1。与N 组比较，M 组CMDI、TDI 评分显著增加（P<0.05）；
与M 组比较，SYD 组、MES 组、SYD +MES 组给药14 d 后CMDI 和TDI 评分均有不同程度降低（P<0.05）；
分别与SYD 组及MES 组比较，SYD+MES 组用药14 d 后CMDI 和TDI 评分进一步降低（P<0.05）。见表6。
图1 大鼠结肠组织HE染色结果（×200）
表6 各组大鼠CMDI和TDI评分比较（分，±s）
注：与N组比较，①P<0.05；
与M组比较，②P<0.05；
与SYD组比较，③P<0.05；
与MES组比较，④P<0.05
TDI评分0 3.75±0.50①2.50±0.58②2.00±0.82②1.75±0.51②③④组 别N组M组SYD组MES组SYD+MES组n4 4 4 4 4 CMDI评分0 4.50±0.79①3.08±0.79②2.17±0.57②③1.42±0.51②③④
3.3 各组大鼠血浆和结肠炎症细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平比较 与N 组比较，M 组血浆和结肠炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的表达水平明显升高（P<0.05）；
与M 组比较，SYD 组、MES 组及SYD+MES 组的TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平明显降低（P<0.05）；
分别与SYD 组及MES 组比较，SYD+MES 组TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达水平进一步降低（P<0.05）。见表7、表8、表9及图2。
图2 各组大鼠结肠TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表达（Western Blot 法）
表7 各组大鼠血浆TNF-α、IL-1β和IL-6水平比较（pg/ml,±s）
表7 各组大鼠血浆TNF-α、IL-1β和IL-6水平比较（pg/ml,±s）
注：与N组比较，①P<0.05；
与M组比较，②P<0.05；
与SYD组比较，③P<0.05；
与MES组比较，④P<0.05
TNF-α 396.56±90.23 1 253.44±192.11①990.78±201.17②830.19±130.57②641.34±120.48②③④组 别N组M组SYD组MES组SYD+MES组n8 8 8 8 8 IL-1β 160.38±65.74 802.59±131.35①653.28±81.19②549.45±79.93②402.79±87.93②③④IL-6 341.50±135.32 1 379.10±257.26①1 100.40±173.59②820.08±161.03②③550.28±132.28②③④
表8 各组大鼠结肠TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相对表达比较（±s）
表8 各组大鼠结肠TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相对表达比较（±s）
注：与N组比较，①P<0.05；
与M组比较，②P<0.05；
与SYD组比较，③P<0.05；
与MES组比较，④P<0.05
TNF-α mRNA 1.099±0.476 6.620±1.181①4.696±0.942②4.397±1.121②2.998±0.583②③④组 别N组M组SYD组MES组SYD+MES组n8 8 8 8 8 IL-1β mRNA 1.019±0.171 5.163±0.792①3.689±0.866②3.295±0.716②2.317±0.573②③④IL-6 mRNA 0.984±0.138 5.571±0.818①4.266±0.747②3.474±0.622②2.511±0.469②③④
表9 各组大鼠结肠TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白相对表达量比较（±s）
表9 各组大鼠结肠TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白相对表达量比较（±s）
注：与N组比较，①P<0.05；
与M组比较，②P<0.05；
与SYD组比较，③P<0.05；
与MES组比较，④P<0.05
TNF-α 0.226±0.066 1.033±0.102①0.850±0.078②0.763±0.092②0.450±0.056②③④组 别N组M组SYD组MES组SYD+MES组n8 8 8 8 8 IL-1β 0.159±0.045 0.952±0.128①0.823±0.068②0.686±0.094②③0.329±0.040②③④IL-6 0.189±0.049 0.995±0.156①0.841±0.105②0.691±0.079②③0.372±0.057②③④
3.4 各组大鼠结肠Notch1/NF-κB 信号通路蛋白表达比较 与N 组比较，M 组Notch1 和NICD 蛋白表达显著降低，胞浆IκBα 和NF-κB p65 的磷酸化水平明显升高，NF-κB p65 核转移水平显著升高（P<0.05）。与M 比较，SYD 组、MES 组及SYD+MES 组Notch1 和NICD 蛋白表达显著升高，胞浆IκBα 和NF-κB p65磷酸化水平明显下降，NF-κB p65 核转移水平显著下降（均P<0.05）。分别与SYD 组及MES 组比较，SYD+MES 组Notch1 和NICD 蛋白表达进一步升高，胞浆IκBα 和NF-κB p65 磷酸化水平进一步下降，NF-κB p65 核转移水平进一步下降（P<0.05）。见图3、图4 及表10、表11。
图4 各组大鼠结肠细胞浆IκBα、NF-κB p65蛋白磷酸化情况和NF-κB p65核转移情况（Western Blot法）
表10 各组大鼠结肠Notch1和NICD的蛋白相对表达量比较（±s）
表10 各组大鼠结肠Notch1和NICD的蛋白相对表达量比较（±s）
注：与N组比较，①P<0.05；
与M组比较，②P<0.05；
与SYD组比较，③P<0.05；
与MES组比较，④P<0.05
NICD 0.831±0.068 0.168±0.053①0.371±0.046②0.460±0.053②③0.567±0.081②③④组 别N组M组SYD组MES组SYD+MES组n8 8 8 8 8 Notch1 1.039±0.084 0.211±0.066①0.467±0.048②0.575±0.065②③0.705±0.103②③④
表11 各组大鼠结肠细胞浆IκBα、NF-κB p65蛋白磷酸化情况和NF-κB p65核转移情况（±s）
表11 各组大鼠结肠细胞浆IκBα、NF-κB p65蛋白磷酸化情况和NF-κB p65核转移情况（±s）
注：与N组比较，①P<0.05；
与M组比较，②P<0.05；
与SYD组比较，③P<0.05；
与MES组比较，④P<0.05
NF-κB p65 0.133±0.035 0.803±0.193①0.637±0.087②0.479±0.098②③0.316±0.052②③④组 别N组M组SYD组MES组SYD+MES组n8 8 8 8 8 p-IκBα 0.199±0.053 1.204±0.289①0.956±0.130②0.719±0.147②③0.477±0.078②③④p-NF-κB p65 0.221±0.051 1.373±0.231①0.766±0.074②0.575±0.092②③0.393±0.056②③④
图3 各组大鼠结肠Notch1 和NICD的蛋白表达（Western Blot法）
UC 是一种慢性炎症性胃肠道疾病，其病因尚不清楚。美沙拉嗪是临床上治疗UC 的主要药物，但临床发现部分患者采用MES 治疗后效果不理想并且长期运用对肝肾具有较大毒性作用。研究发现，甘草泻心汤能够提高美沙拉嗪治疗UC 的疗效［6］。本研究结果发现，与模型组比较，给药7 d 和14 d 后，芍药汤组及美沙拉嗪组DAI 及CMDI 评分明显降低，而分别与芍药汤组及美沙拉嗪组比较，芍药汤联合美沙拉嗪组DAI 及CMDI 评分均进一步降低；
HE 染色也发现，与模型组比较，芍药汤组及美沙拉嗪组肠黏膜上皮病理损伤明显减轻，TDI评分明显降低；
分别与芍药汤组及美沙拉嗪组比较，芍药汤与美沙拉嗪联合用药组结肠损伤程度进一步减轻，TDI 评分进一步降低。同时本实验还发现，芍药汤及美沙拉嗪均能降低UC 大鼠血浆和结肠TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达水平，但分别与芍药汤及美沙拉嗪比较，芍药汤与美沙拉嗪联合用药后UC 大鼠血浆和结肠TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达水平进一步降低，表明联合用药抗炎作用更明显。
有研究表明，NF-κB 信号通路介导的炎症反应是UC 发生的主要分子机制［14-15］。研究表明，芍药汤通过影响TLR4/NF-κB 信号通路而对UC 大鼠起保护作用［7］，但TLR4 受体激活后是如何介导NF-κB 活化进而导致炎症反应的，目前还不太清楚。另有研究报道，葛根芩连汤通过调节Notch1 信号，可恢复结肠黏膜的再生和稳态而缓解UC［16］。本研究发现，在UC大鼠结肠组织中Notch1 及NICD 表达水平明显降低，磷酸化的IκBα 和NF-κB p65 水平明显升高，NF-κB p65核转移水平显著升高。芍药汤或美沙拉嗪给药14 d后UC 大鼠结肠Notch1 及NICD 蛋白表达水平显著升高,IκBα 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平明显下降,NFκB p65 核转移水平显著下降。而与芍药汤组或美沙拉嗪组比较，芍药汤联合美沙拉嗪连续给药14 d 后UC 大鼠结肠Notch1 及NICD 蛋白表达水平进一步升高；
IκBα 和NF-κB p65 蛋白磷酸化水平进一步下降；
NF-κB p65 核转移水平进一步下降。因此,我们推测芍药汤联合美沙拉嗪的抗炎作用可能也与其活化Notch1信号通路、抑制NF-κB信号通路活化有关。
综上所述，芍药汤联合美沙拉嗪对UC 的疗效优于单用美沙拉嗪或芍药汤，作用机制可能与其上调Notch1和NICD 的表达，抑制NF-κB信号通路活化，进而抑制炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达有关。
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