林建平 王 浩 刘海潮 李 明 王诗忠 陈少清
1.福建医科大学健康学院，福建福州 350122；
2.福建医科大学第一临床医学院，福建福州 350122；
3.福建中医药大学康复医学院，福建福州 350122；
骨骼肌损伤超过60%属于钝挫伤[1-2]。越来越多的证据表明，内质网应激可能在肌肉疾病的发病机制中发挥重要作用[3-6]。研究证实，炎症刺激能引起内质网应激，激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）信号通路[7-8]。UPR 在肌肉干细胞稳态、肌原性分化和损伤骨骼肌再生中发挥关键作用[6]。推拿对骨骼肌损伤疗效独特，但作用机制不明确[9]。本研究通过观察推拿对骨骼肌钝挫伤模型大鼠内质网应激：Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）、钙网蛋白（calreticulin，CRT）、葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein of 78 kDa，GRP78）及炎症：肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影响，探讨推拿治疗骨骼肌钝挫伤的起效机制。
1.1 实验动物
SPF 级6 周龄健康雄性SD 大鼠24 只，体重（220±20）g，由福建医科大学动物实验中心提供，许可证号码：SCXK（闽）2016-0002，实验动物合格证号：20170012003202。通过福建医科大学动物伦理审查委员会审批（FJMUIACUC2020-0038）。动物饲养模拟标准日夜系统，室内恒温20℃，相对湿度控制在50%，自由食物和饮水。
1.2 主要试剂与仪器
HE 染色套装（Servicebio 公司，货号：G1003）；
酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（Thermo fisher 公司，货号：MAN0017 380）；
GRP78 抗体（Proteintech 公司，货号：66574-1-Ig）；
CRT 抗体（Proteintech 公司，货号：10292-1-AP）；
GoatAnti-MouseIgG（Proteintech公司，货号：SA00001-1）；
GoatAnti-RabbitIgG（Proteintech公司，货号：SA00001-2）；
自制大鼠固定器（ZL202120268993.6，发明人：林建平），自制推拿按摩指套（ZL201821318407.9，发明人：林志刚）。
1.3 动物分组
大鼠先适应性饲养1 周，采用随机数字表法将24 只大鼠分为四组：空白组、模型组、推拿穴位组、推拿非穴位组，每组6 只。空白组仅常规喂养，其余建立大鼠腓肠肌钝挫伤模型。
1.4 制作大鼠腓肠肌钝挫伤模型
通过特定装置撞击大鼠右后肢腓肠肌，制作大鼠腓肠肌钝挫伤模型[10-11]。腹腔注射10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉大鼠后，将170 g 重物通过导管从0.7 m 的高度落下，精准打击到大鼠肌肉腹部，每次打击动能约为1.166 2 J，实验过程共打击5 次，总的打击能量为5.831 J。
造模成功标准：肉眼可见大鼠皮肤出现瘀斑，损伤部位明显红肿，HE 染色观察到大鼠打击部位肌纤维排列散乱、出现断裂、溶解和瘢痕组织[11-12]。
1.5 推拿干预
造模1 d 后开始推拿干预，采用自制推拿按摩指套点按右侧阴陵泉，刺激力量为4 N，每次点按30 s，间隔10 s，共点按20 次，连续7 d。推拿非穴位组：取阴陵泉同一水平线与胆经和膀胱经的中线相交点，其他操作同推拿穴位组。
1.6 观察指标及方法
1.6.1 HE 染色观察大鼠肌肉组织形态 将各组腓肠肌标本从4%多聚甲醛中取出，依次梯度酒精脱水后包埋成蜡块，切片、烤片后用HE 染色，后无水乙醇、二甲苯中脱色透明，封片，光学显微镜下观察。
1.6.2 ELISA 测定骨骼肌TNF-α 及其SERCA 含量取出标本，加入一定比例裂解液，在4℃、离心半径13 cm、14 000 r/min 离心10 min后，取上清液进行ELISA 测定，根据ELISA 试剂盒说明书步骤进行实验操作。
1.6.3 Western blot 测定CRT、GRP78 表达 取出标本，加入一定比例裂解液，4℃、离心半径8 cm、14 000 r/min 离心20 min 后，取出上清液，检测蛋白浓度，变形，上样，SDS-PAGE 电泳分离、转膜、封闭、孵一抗（GRP78 浓度为1∶5 000，CRT 浓度1∶5 000）和二抗分别为Goat Anti-Mouse IgG 和Goat Anti-Rabbit IgG，稀释浓度均为1∶5 000，洗膜后加入显影液进行显影处理，最后使用Image-lab 软件进行灰度值的测量。
1.7 统计学方法
采用SPSS 23.0 软件进行数据统计。计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用单因素方差分析，当满足方差齐性检验时采用LSD-t 法进行不同组间两两比较，方差不齐时采用Tamhane’s T2 分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠腓肠肌组织形态学比较
空白组肌纤维横切面排列致密，没有出现断裂或瘢痕组织，结构完整清晰（图1A）。模型组肌纤维明显散乱、断裂，部分肌纤维出现溶解，瘢痕组织面积较大（图1B）。推拿穴位组肌纤维排列较整齐，断裂、溶解、瘢痕组织明显减少（图1C）。推拿非穴组仍残留较多的瘢痕组织，肌纤维排列较为疏松（图1D）。
图1 各组大鼠腓肠肌组织形态学比较（黑色箭头表示肌纤维明显断裂，部分肌纤维出现溶解，HE 染色，100×）
2.2 各组大鼠腓肠肌组织中TNF-α 含量比较
与空白组比较，模型组大鼠腓肠肌中TNF-α 含量升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；
与模型组比较，推拿穴位组、推拿非穴组大鼠腓肠肌中TNF-α含量均降低（P＜0.05 或P＜0.01）；
与推拿非穴位组比较，推拿穴位组中TNF-α 含量低于推拿非穴位组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。
表1 各组大鼠腓肠肌组织中TNF-α 含量比较（pg/ml，）
表1 各组大鼠腓肠肌组织中TNF-α 含量比较（pg/ml，）
注 与空白组比较，aaP＜0.01；
与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；
与推拿非穴位组比较，cP＜0.05。TNF-α：肿瘤坏死因子-α
2.3 各组大鼠腓肠肌组织中SERCA 含量比较
与空白组比较，模型组大鼠腓肠肌中SERCA 含量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与模型组比较，推拿穴位组、推拿非穴组大鼠腓肠肌SERCA 含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
推拿穴组中SERCA含量与推拿非穴位组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。
表2 各组大鼠腓肠肌组织中SERCA 含量比较（pg/ml）
表2 各组大鼠腓肠肌组织中SERCA 含量比较（pg/ml）
注 与空白组比较，aP＜0.05；
与模型组比较，bP＜0.05。SERCA：Ca2+-ATP 酶
2.4 各组大鼠腓肠肌GRP78、CRT 表达比较
与空白组比较，模型组大鼠腓肠肌中GRP78、CRT 蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）；
与模型组比较，推拿穴位组、推拿非穴组大鼠腓肠肌中GRP78、CRT 蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）；
与推拿非穴位组比较，推拿穴组中GRP78、CRT 蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表3。
图2 大鼠腓肠肌GRP78、CRT 蛋白条带图
表3 各组大鼠腓肠肌组织中GRP78、CRT 蛋白表达比较（积分光密度值，）
表3 各组大鼠腓肠肌组织中GRP78、CRT 蛋白表达比较（积分光密度值，）
注 与空白组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；
与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01；
与推拿非穴位组比较，cP＜0.05。GRP78：葡萄糖调节蛋白78；
CRT：钙网蛋白
内质网是Ca2+贮存和蛋白质加工主要场所，骨骼肌损伤后引起SERCA 功能受损，使Ca2+回收受阻，Ca2+失调通过促进线粒体的活性氧等物质的产生，从而扰乱内质网腔内的蛋白质正常折叠，促使异常蛋白质生成增多[13]，从而导致内质网过度应激[14]。内质网过度应激加重细胞炎症、自噬、凋亡反应[15]。本研究发现推拿可有效改善骨骼肌钝挫伤大鼠肌肉的病理形态，上调SERCA 表达，并抑制炎症因子TNF-α 和内质网应激蛋白（CRT、GRP78）的表达。
在胰岛β 细胞、肝细胞和巨噬细胞等多种细胞中，均发现促炎性细胞因子TNF-α 的释放，引发或加剧内质网应激[7]。促炎性细胞因子能直接下调内质网膜上SERCA 表达使内质网中Ca2+水平降低，从而引起内质网应激[8,16]。此外，过度炎症时，高浓度的细胞溶解物和毒素会损伤肌肉组织，使修复效率大大降低[17]。研究表明，推拿具有很好的抗炎作用[18-19]。本研究亦显示推拿可改善骼肌钝挫伤模型大鼠的TNF-α 表达，上调SERCA 表达。提示推拿有效抑制炎症，促进内质网钙泵功能，从而影响肌肉损伤的修复。
GRP78、CRT 是存在内质网中的Ca2+依赖分子伴侣，广泛参与了蛋白质的折叠和转运功能[20]。未折叠或错误折叠蛋白增加时，GRP78 通过解离并激活内质网的3 个跨膜信号蛋白：f 肌醇酶1，蛋白激酶R 样内质网激酶和转录激活因子6[21]，从而启动UPR 反应[22-23]。骨骼肌损伤可引起内质网异常折叠蛋白的聚集和滞留而上调GRP78、CRT 表达[24-25]。结果显示，推拿可下调CRT、GRP78 表达，且推拿穴位组低于推拿非穴组，提示推拿可抑制内质网应激，且推拿穴位优于推拿非穴位。
综上所述，推拿有效改善骨骼肌钝挫伤大鼠的肌肉病理形态，其作用机制可能与上调SERCA，抑制TNF-α、CRT、GRP78 表达相关。
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