罗欢欢，冯泽宇，李 捷，谢艳华，田惠玲，肖会敏，王四旺*，李志平
1.西北大学生命科学与医学部，西安 710069；
2.陕西汉王药业股份有限公司，汉中 723000；
3.空军军医大学中药与天然药物教研室，西安 710032
强力定眩片(Qiangli Dingxuan Tablets，QLDXT)是陕西汉王药业股份有限公司独家生产的复方制剂，系由天麻、杜仲、杜仲叶、野菊花、川芎5味中药组成， 该药能扩张血管，降低血黏稠度，临床疗效显著[1-4]。其目前临床应用最多的适应证主要集中在各种原因所致的眩晕性疾病[5-6]。中药药代动力学可以揭示多成分之间的相互作用，是中药化学与中药药效学研究之间的桥梁和纽带，为中药物效基础研究中的关键一步[7-8]。
为保证QLDXT的安全性和规范临床用药，课题组前期对QLDXT中的化学成分作了物质归属，其主要成分包含黄酮类、有机酚酸类、挥发油类等。并用HPLC法建立了制剂的指纹图谱和13种成分的含量测定，有关QLDXT药代动力学尚未报道。为明确QLDXT在体内含量的经时变化，本实验以相关文献报道和课题组对制剂中13个代表成分的含量研究为基础，用HPLC法对QLDXT的入血成分进行研究。
迄今为止，有关QLDXT的报道多集中于临床研究，而其在体内以何种成分、何种形式发挥作用，至今尚属空白。本试验建立快速、灵敏的HPLC法，并用于QLDXT大鼠血浆中天麻素(gastrodin, GAS)和藁本内酯(ligustilide, LIG)的测定，为阐明其药效物质基础，深入研究人体药动学以及设计合理的用药方案提供参考。
1.1 仪器
LC-2030plus高效液相色谱仪(SHIMADZU公司)；
BSA124S电子分析天平(德国Sartorius)；
氮吹仪(天津恒奥科技有限公司)；
快速涡旋混匀器(江苏新康医疗器械有限公司)；
低温高速离心机(德国Eppendorf公司)。
1.2 试药
强力定眩片药粉(批号279011-006009，陕西汉王药业股份有限公司)。对照品：天麻素(质量分数≥98%，批号HR16313B1)、藁本内酯(质量分数≥98%，批号HL09355198)，均购自宝鸡辰光生物科技有限公司。肝素钠(苏州亚科科技有限公司)；
甲酸(天津大茂化工有限公司)；
甲醇、乙腈均为色谱纯，购自美国Fisher公司。
1.3 动物
雄性SD大鼠，SPF级，体质量(220±50) g，由空军军医大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(陕)2019-001。
2.1 色谱条件
色谱柱：Lamdo Stamsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相1 mL·L-1甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～2 min，3%～7% B；
2～20 min，7% B；
20～30 min，7%～12% B；
30～90 min，12%～30% B)。检测波长：220、280 nm，进样量：30 μL；
流速为0.7 mL·min-1；
柱温为30 ℃。
2.2 强力定眩片灌胃药液的制备
精密称取强力定眩片药粉适量，置于洁净烧杯中，加入超纯水适量，超声(功率250 W，频率：40 kHz)混匀，即得0.42 g·mL-1的强力定眩片灌胃药液。
2.3 混合对照品母液及系列对照品溶液的制备
取GAS、LIG对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.508 、1.236 mg·mL-1的混合对照品母液。精密吸取混合对照品母液加甲醇稀释成7个系列对照品溶液(GAS质量浓度分别为101.6、50.8、25.4、12.7、6.35、5.29、3.18 μg·mL-1，LIG质量浓度分别为247.20、123.60、61.80、30.90、15.45、12.88、7.73 μg·mL-1)，置于4 ℃冰箱中避光保存备用。
2.4 血浆样品处理
精密吸取血浆200 μL，加入乙腈600 μL，涡旋2 min，离心10 min(4 ℃，13 000 r ·min-1)，小心吸取全部上清于40 ℃氮气流下吹干，残渣加200 μL 体积分数为50%的甲醇复溶，离心10 min(4 ℃，13 000 r·min-1)，取上清，待测。
2.5 方法学考察
2.5.1专属性实验 分别取大鼠空白血浆、空白血浆加对照品和内标、给药后的大鼠血浆样品加内标，按2.4项下方法处理，并按2.1项下色谱条件进样分析，得到空白血浆、空白血浆+对照品、给药后血浆样品色谱图(图1)。结果显示，天麻素与藁本内酯的测定不受血浆中杂质及内源性物质的干扰，且待测成分可实现完全分离，表明建立的方法专属性良好。
注：A.空白血浆；
B.空白血浆加对照品；
C.大鼠含药血浆色谱图；
1.天麻素；
2.藁本内酯。
2.5.2标准曲线和线性范围 分别吸取2.3项下的系列对照品溶液各20 μL，加入200 μL空白血浆中，配制成相应的系列质量浓度含药血浆样品，按照2.4项下方法处理，按2.1项下的色谱条件进样。以各成分质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归，线性方程和范围见表1。结果表明，天麻素和藁本内酯在各自质量浓度范围内线性关系良好，r≥0.999 5。
表1 天麻素和藁本内酯标准曲线及线性范围
2.5.3精密度和准确度 取200 μL大鼠空白血浆共6份，加入2.5.2项下配制的高、中、低3个质量浓度的GAS、LIG溶液20 μL，制成制成高、中、低3个质量浓度的质控样品(QC)，再按照2.4项下方法处理，日内组1 d内连续测定6次，日间组每天测定1次，连续6 d，记录GAS和LIG的峰面积，根据标准曲线计算其质量浓度。结果，血浆中2种成分的日内、日间准确度RE在-13.07%～7.70%之间，日内、日间精密度RSD在0.95%～10.03%之间，均符合生物样品分析测定方法的要求。见表2。
表2 大鼠血浆中GAS和LIG的精密度和准确度 (n=6)
表3 大鼠血浆中GAS和LIG的回收率 (n=6)
2.5.5稳定性实验 按2.5.3项下含药血浆样品的制备方法，对高、中、低质量浓度的血浆样品进行稳定性考察。室温放置4 h，考察其室温稳定性；
-20 ℃冰箱中反复冻融3次，考察其反复冻融稳定性；
-80 ℃冰箱中冷冻30 d，检测其长期稳定性。结果，样品在短期、长期、反复冻融稳定性试验中RSD均在1.07%～10.15%之间，RE在-10.56%～12.70%之间，说明血浆样品在上述考察条件下均稳定，符合生物样品检测的要求，结果见表4。
表4 大鼠血浆中GAS和LIG的稳定性 (n=6)
2.6 药代动力学研究
选取健康雄性SD大鼠，实验前禁食12 h，自由饮水，按6 g·kg-1(按15 mL·kg-1)的剂量灌胃给药，每只大鼠于给药前及给药后0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10 h眼眶静脉丛取血，每次取血约0.5 mL，置于用10 μL 10 g·L-1肝素钠浸润过的EP管中，以3 000 r·min-1离心10 min，吸取上层血浆，按2.4项下方法处理，按2.1项下条件进样分析。用DAS2.0软件进行药代动力学拟合计算，获得天麻素、藁本内酯平均药时曲线与相关药代动力学参数。拟合结果GAS与LIG药动学特征符合二室模型，药动学参数与各组分药-时曲线见图2、表5。结果显示，大鼠给药5 min后血中可以检测到GAS和LIG，二者均在0.5 h左右达峰，半衰期较短，分别为8.47 、7.70 h。Cmax分别为(32.37±1.23)、(230.32±2.99) mg·L-1。LIG的Cmax和AUC均较大，有利于发挥疗效。CLz/F分别为(20.22±5.52)、(11.61±1.11) L·h·kg-1，Vz/F分别为(220.41±30.51)、(114.42±153.15) L·kg-1，两者的MRT(0～t)、 MRT(0～∞)较小；
提示在体内的滞留时间短，消除速度快。综上表明，2种成分在大鼠体内吸收迅速，起效快，不易蓄积；
提示QLDXT临床用药时二次用药时间的间隔不能太长，否则难以维持有效血药质量浓度。
注：A.天麻素；
B. 藁本内酯。
3.1 测定成分的选择
灌胃后血浆中主要检测到天麻素(gastrodin, GAS)、藁本内酯(ligustilide, LIG)、东莨菪内酯、没食子酸4 种成分，且这4 种成分均为LC-MS物质归属中检测到的成分。研究表明GAS为君药天麻中的主要成分，具有抗眩晕、降压、降血脂、降血糖、降低血液黏稠度、脑缺氧保护、抗血小板聚集等多种药理效应[9-14]。川芎苯酞类成分具有保护心脑血管、改善血液流变和调节血脂代谢的作用，而LIG则是这些药效成分之一[15-16]。
表5 GAS和LIG的主要药代动力学参数
由于没食子酸和东莨菪内酯的分离度较差，且内源性干扰较大，峰面积较小，该条件下提取回收率较低，因此未能对其进行定量研究。研究表明，达峰质量浓度(Cmax)和血药质量浓度-时间曲线下面积(AUC0～∞)是评价活性成分体内暴露量的2个重要指标，药效活性较强且体内暴露显著的成分可能为复方中的药效物质基础[17-18]，故选择GAS、LIG作为QLDXT药动学研究的指标成分。
3.2 色谱条件选择
实验中尝试了不同品牌和规格的色谱柱，如：Thermo Syncronis C18(50 mm×2.1 mm，5 μm)、Lamdo Stamsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，最终以Lamdo Stamsil C18柱(250×4.6 mm，5 μm)分离效果较理想。
3.3 样品前处理方法的优化
蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法是测定生物样品时常用的样品前处理方法。蛋白沉淀法因具有操作简单、经济实用的特点，故目前最常用。本实验中比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇-乙腈(1∶1)、甲醇-乙酸乙酯(1∶1)等不同的处理方法。结果显示，以上条件下目标峰峰面积无显著差异，但乙腈沉淀蛋白较为完全，且重复性好，内源性干扰较少，目标峰的提取回收率较高，峰形良好，故用乙腈作为蛋白沉淀剂。实验初期采用乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水(B)为流动相时，发现目标峰严重拖尾，而采用甲酸后，峰形得以改善。因此，最终选择乙腈除去血浆中的蛋白，乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水(B)作为流动相。氮吹是富集成分、提高检测质量浓度的常用方法[19]。为提高目标峰的检测质量浓度，采用了氮吹复溶的方法。
3.4 药动学结果分析
强力定眩片6 g·kg-1灌胃给予大鼠后0.5 h左右GAS和LIG在血浆中即达到较高的质量浓度，Cmax分别为32.37 mg·L-1和230.32 mg·L-1，藁本内酯的Cmax和AUC均较高，有利于发挥疗效。CLz/F分别为20.22 L·h·kg-1和11.61 L·h·kg-1，Vz/F分别为220.41 L·kg-1和114.42 L·kg-1，两者的MRT(0～t)、 MRT(0～∞)较低；
提示在体内的滞留时间短，消除速度快。实验前期对10 批强力定眩片样品进行检测时LIG在样品中的含量并不是最高，可能是LIG脂溶性较大，更易透过生物膜进入体内。综上表明，GAS和LIG在大鼠体内吸收迅速，起效快，不易蓄积；
提示强力定眩片临床用药时的二次给药时间不能间隔太长，否则难以维持有效成分的血药质量浓度。
本实验首次研究了QLDXT中GAS和LIG在大鼠体内的药代动力学特点，发现其体内药代动力学过程符合二室模型，分布消除迅速,半衰期和血浆清除率均比较稳定。这些结果为QLDXT的组织分布研究奠定了基础。
综上，本实验建立了一种简便、快速的HPLC法，并用于QLDXT血浆中GAS和LIG的测定，为阐明其物效基础等提供依据。但该方法仅检测了血浆中的两种成分，可能原因一是成药中的含量低，HPLC检测限不能检出；
二是有可能代谢成其他产物，且目前各成分在机体内的暴露和药效与靶器官之间的相互作用规律还不明确。后续将重点研究入血成分体内暴露量和药效与靶器官之间的联系及QLDXT中的其他成分的药代动力学特征。