景 鑫，王德琴 缪娴静
糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是最常见的糖尿病血管病变相关并发症，是导致2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者发生肾功能衰竭，残疾甚至死亡的常见原因[1-2]。有效辨别早期DN 患者，是尽早采取干预措施，保护患者肾功能，改善其预后的必要前提。但早期DN 发病隐匿，常见的肾功能损伤指标在诊断早期DN 中的灵敏度不高，寻找可靠的指标，有效诊断早期DN，在临床中具有重要价值[3]。视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein,RBP)是一种由肝脏分泌的低分子量蛋白，正常情况下，RBP 排泄量较小，但当肾小管受损，尿排泄量增多，其在反映DN 中具有一定价值[4]。随着分子学的不断进展，有研究发现，不少微小RNA(miRNA)参与DN 肾小管间质纤维化以及肾小管损伤，在诊断早期DN 中也具有良好潜能[5]。为研究尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平联合检测在诊断早期DN 中的价值，我们开展了该研究。
1.1 研究对象 将医院2019.01-2021.01 间收治的133 例T2DM 患者纳为研究对象，并将同期50 例健康体检合格者纳为对照组。纳入标准：①患者年龄≥60 岁；
②符合中华医学会糖尿病学会所制定的T2DM 相关诊断标准[6]，口服葡萄糖耐量试验中2 h血糖≥11.1mmol/L；
③入组前3～6 个月内连续进行3次尿白蛋白排出率（urinary albumin excretion rate,UAER）检测；
④对照组为健康体检合格，未合并任何代谢性疾病者。排除标准：①合并免疫系统疾病者；
②合并恶性肿瘤及感染性疾病者；
③合并严重肝肾功能障碍者。根据T2DM 患者24 h 尿蛋白排泄率(UAER)将其分为单纯糖尿病组(T2DM 组，UAER≤30 mg/24 h，n=38)与早期DN 组(30 mg/24 h＜UAER≤300 mg/24 h，n=46)及临床DN组（UAER＞300 mg/24 h，n=49），50例健康体检合格者纳为对照组，4 组一般资料比较，差异无统计学意义。见表1（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会批准（HKL2022165），所有患者均签署知情同意书。
表1 四组一般资料比较
1.2 方法
（1）采集被研究者24 h 尿，日立7600 检测尿RBP水平，所有操作均严格遵照试剂盒相关步骤进行，尿RBP参考范围：0～0.7 mg/mL。
（2）采集被研究者外周静脉血2 mL，3000 r/min离心15 min，取上清液，检测血清microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平。提取RNA 及逆转录：取200 μL 血清，按照德国GiaGen 公司生产的miRNeasy Serum/Plasma Kit 试剂盒相关说明进行总RNA 提取，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit cDNA 合成试剂盒(ABI 公司生产)相关标准合成cDNA，置于-80 ℃冰箱内保存待用。采用ABI 公司生产的TaqMan-PCR 检测试剂盒TaqMan Universal Master Mix Ⅱ检测血清microRNA-183 及microRNA-93-5p水平。microRNA-183引物上游序列：5’-CCTTCACTTTCAGGGTCGAG-3’，下游序列：5’-CAGTTTGGGACCCCTTTACA-3’。microRNA-93-5p 引物上游序列：5’-AGTCTCTGGCTGACTACATCACAG-3’，下游序列：5’-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3’。内参U6 上游序列：5’-CACGGCAAATTCAACGGCACAG-3’，下游引物序列为：5’-AGACACCAGTAGCATCCACGAC-3’。引物均由上海生物工程有限公司合成。
PCR 反应总体5 μL，包括1×TaqMan Universal Master Mix Ⅱ、1×TaqMan 探针与引物以及15 ng cDNA，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃15 s，60 ℃1 min，50 个循环，每个样本PCR 反应重复3次，设立阳性、阴性以及空白对照，监控检测质量，U6 作为内参，分析血清microRNA-183 及microRNA-93-5p相对表达水平。
1.3 观察指标（1）比较四组肾功能相关指标；
（2）比较四组尿RBP、血清microRNA-183及microRNA-93-5p水平；
（3）分析血清microRNA-183及microRNA-93-5p 水平与肾功能指标之间的相关性；
（4）绘制受试者工作特征曲线(receiver operatingchara cteristic,ROC)，分析尿RBP、血清microRNA-183 及microRNA-93-5p在诊断早期DN中的价值。
1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示，多组间比较使用单方差分析，检验有意义者，两两比较采用LSD-t检验；
计数资料用[n(%)]表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Pearson 相关分析，绘制ROC，并使用约登指数公式计算最佳临界值，评价UACR、尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p 诊断早期DN 的性能，采用二元logistic 回归分析得出联合预测因子，分析各指标联合应用在诊断早期DN中的价值，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 四组一般资料比较 四组性别、年龄、血压、体质量指数等基线资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
2.2 四组尿白蛋白/尿肌酐（UACR）水平比较 与对照组、T2DM 组、早期DN 组比较，临床DN 组患者UACR水平显著升高（P＜0.05）。与对照组、T2DM组比较，早期DN组患者UACR水平显著升高（P＜0.05）。见表2。
表2 四组研究对象尿白蛋白/尿肌酐（UACR）水平比较()
表2 四组研究对象尿白蛋白/尿肌酐（UACR）水平比较()
与对照组比较，aP＜0.05；
与T2DM 组比较，bP＜0.05；
与早期DN 组比较，cP＜0.05。
2.3 四组尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p水平比较
对照组和T2DM 组尿RBP、血microRNA-183及microRNA-93-5p 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组尿RBP 水平均低于早期DN 组及临床DN 组，血microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平均高于早期DN 组及临床DN 组，且早期DN 组尿RBP水平均低于临床DN 组，血microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平均高于临床DN 组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。
表3 四组尿RBP、血microRNA-183及microRNA-93-5p水平比较()
表3 四组尿RBP、血microRNA-183及microRNA-93-5p水平比较()
与对照组比较，aP＜0.05，与T2DM 组比较，bP＜0.05，与早期DN 组比较，cP＜0.05
2.4 尿RBP、血microRNA-183、microRNA-93-5p水平与UACR 间的关系分析 相关性分析提示，尿RBP 与UACR 水平之间呈正相关（P＜0.05），血microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平与UACR之间呈负相关（P＜0.05）。见表4。
表4 尿RBP、血microRNA-183、microRNA-93-5p水平与UACR的关系分析
2.5 尿RBP、血microRNA-183、microRNA-93-5p水平在诊断早期DN 中的价值分析 将对照组、早期DN 患者和单纯糖尿病患者的数据进行研究，绘制ROC曲线发现，尿RBP、血microRNA-183及microRNA-93-5p 在诊断早期DN 中的AUC 均超过0.75，且尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p 三者联合应用可有效提高各指标单独应用时的效能，提高早期DN诊断效果。见表5。
表5 尿RBP、血microRNA-183、microRNA-93-5p水平在诊断早期DN中的价值分析
早期DN 对肾脏的损伤是可逆的，但一旦错过早期可逆的治疗机会，肾功能将不断恶化，故早期DN 的诊断在改善患者预后中具有重要的意义。UACR 是目前诊断DN 的常见指标，但其准确率不高[7]。此外，随机尿的白蛋白/肌酐比值UACR 是诊断糖早期尿病肾病的相对较为通用的指标，但是在诊断肾功能损伤中的价值有限[9-11]。本研究发现，早期DN 组患者UACR 水平与对照组及T2DM 组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），而临床DN 组患者UACR 水平明显高于早期DN 组患者。然而，根据绘制的ROC 曲线发现，UACR 指标在诊断早期DN中的效能反而不高。
寻找新型、灵敏，可用于诊断早期DN的指标已成为目前研究的重点。RBP主要由肝细胞合成，主要负责将视黄醇从肝细胞转移至上皮细胞，血浆内RBP主要以与甲状腺素结合蛋白结合为高分子蛋白质复合物形式存在，其排泄量微小，但当肾小管受损后，其排泄量将剧增[12-13]。本文中，T2DM 组及对照组RBP水平相似，但早期DN及临床DN患者尿RBP水平明显升高，且临床DN患者尿RBP水平更高，提示尿RBP 在反映患者肾脏损伤，诊断早期DN 中具有重要意义[14]。绘制ROC曲线发现，尿RBP在诊断早期DN中的AUC=0.786，诊断效能较高。
miRNA是一种小分子非编码RNA，参与多种生理及病理过程。有学者发现，miR-133b、miR-342等在早期预测肾功能损伤中的价值优于MAU。且不少miRNA参与肾小球及肾小管损伤[15-16]。microRNA-183 属于miR-183 家族，由7 号染色体转录而来，与多种恶性肿瘤间存在密切联系。Qi等[17]发现，上调miR-183 可抑制狼疮性肾炎小鼠肾纤维化及炎症反应，发挥肾功能保护功效。Yang等[18]研究表示，microRNA-93-5p 表达增加可降低CDKN1A，抑制DN 小鼠肾间质纤维化，提示microRNA-93-5p表达上调在保护肾脏中具有价值。本研究发现，早期DN 以及临床DN 患者血microRNA-183 及microRNA-93-5p 及水平明显低于对照组以及单纯T2MD 患者，且DN 患者血microRNA-183 及血microRNA-93-5p水平与UACR 水平均呈负相关，绘制ROC 曲线提示，血microRNA-183 及microRNA-93-5p 在诊断早期DN 中的效能较高，其AUC 均超过0.75，分别为0.790与0.818，且尿RBP、血microRNA-183、血microRNA-93-5p联合应用在诊断早期DN中的AUC最大，为0.939，95%CI为(0.877～1.000)。
综上所述，尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p 在诊断早期DN 中的效能均高于UACR，可成为诊断早期DN的潜在指标。
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