陆媛媛,李 力
(1.广西贵港市人民医院妇科，贵港 537100;2.广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科暨区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点室验室，南宁 530021)
全球范围内，每年卵巢癌新发病例239000例(3.6%的癌症病例)，死于卵巢癌病例152000例(占所有癌症死亡的4.3%)，是妇科癌症第二最常见的死亡原因[1]。早期诊断及后续规范系统治疗是卵巢癌预后的基础，在分子水平则受多分子精细调控机制影响，其中体细胞突变有重要的影响[2-3]。随着癌症基因组学的进步和成本的不断降低，越来越多全外显子组测序和全基因组测序的数据集发表，并且这些表征数据一般为体细胞突变，人类致癌过程中潜在的体细胞突变过程现逐渐通过癌症基因组中的突变模式被揭示出来，因此体细胞变异为许多分析提供了基线数据，如驱动基因检测，通路分析，突变特征和肿瘤异质性的评估等[2,4]。
癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)目前共收录了33种癌症相关的各种组学数据(包括基因组、蛋白组等组学数据)，数据库的建立帮助生成了许多大规模的癌症基因组数据集，并使全面的生物信息学分析成为可能。为更好的对体细胞突变数据进行可视化分析，Mayakonda等[5]开发了一个对用户友好的R-Bioconductor包，称之为“Maftools”。
肿瘤将循环肿瘤DNA(ctDNA)释放到血液中，在癌症管理和监测中，其为组织活检无创性的补充肿瘤突变的信息。目前卵巢上皮性癌基因组学研究多来源于组织样本，卵巢上皮性癌血浆ctDNA体细胞突变的研究不多，本研究通过下载TCGA数据库卵巢上皮性癌组织体细胞突变信息，利用Maftools软件包分析数据，探索卵巢上皮性癌组织样本的体细胞变异情况，分析发挥作用的功能和信号通路，为研究卵巢上皮性癌血浆样本ctDNA体细胞突变提供参考。
1.1 卵巢上皮性癌体细胞突变数据的获取 卵巢上皮性癌患者的基因表达谱数据来自2021年6月1日TCGA(https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)数据库，使用TCGAmutations下载卵巢上皮性癌相关突变数据以及临床数据。
1.2 卵巢上皮性癌体细胞突变分析 使用R语言(R Development Core Team，R 4.0.2版)的maftools包(R-maftools)(https://github.com/PoisonAlien/maftoolsContact:csiamt@nus.edu.sg)对突变数据进行有效汇总、分析和可视化MAF格式的文件。具体操作：载入maftools包，将组学基因突变、拷贝数变异等数据汇总后转换为MAF对象的储存模式；
使用plotmafSummary绘制MAF文件的summary信息；
通过MutSigCV绘制“瀑布图”以展示MAF文件中的变异信息，使用不同颜色的注释区分突变类型(FDR<0.1)。
1.3 突变特征分析 运用titv函数将SNP分类为转换、颠换，汇总数据，并显示每个样本中的转换比例。
1.4 超突变基因组区域的突变分析 超突变基因组区域是染色体上突变率显著高于整个基因组平均突变率的片段。为识别这些区域，通过rainfallPlot参数将超突变的基因组区域可视化，即根据位置对每个染色体的突变进行排序，并在对数变换后计算连续突变之间的距离，称为rainfallplots。如连续变化点合并为基因组片段，且该片段包含6个或6个以上的连续突变，平均突变间距离为<1000bp，则合并为基因组片段，并注释为Kataegis。
1.5 信号通路富集分析 OncogenicPathways功能查看显著富集通路，选择感兴趣的富集通路完成突变展示。
1.6 体细胞突变基因协同和互斥分析 在Maftools中使用somaticInteractions函数检测互斥或协同的基因集，对成对基因，通过对包含突变和非突变样本频率的2×2列联表进行Fisher精确检验来评估互斥或协同的模式。
2.1 卵巢上皮性癌体细胞突变摘要 从TCGA数据库下载411例卵巢上皮性癌患者体细胞突变图谱，摘要图中列出了MAF文件所有变异分类，如移码缺失突变、剪接位点、错义突变、框内缺失、移码插入突变等，其中错义突变比例最高；
变体类型最多为单核苷酸多态性(SNP)；
SNP突变方式比例最高为C到T；
将每个样本分开计算，样本中突变的中位数为68，最大值为1853；
通过箱形图展示了不同样本中每种变体分类数量；
411例卵巢上皮性癌患者中，前10位突变基因(TOP10)分别为TP53、TTN、MUC16、FLG2、CSMD3、AHNAK2、FLG、HMCN1、USH2A、NF1。见图1。
411例样本有396例(96.36%)存在突变，取TOP50高频突变的基因展示，TP53、TTN、FLG2、MUC16、CSMD3、HMCN1、USH2A、AHNAK2、FLG、NF1为卵巢上皮性癌中突变频率最高的十个基因，其中TP53是最常见的突变基因,占比高达91%(图2)。
2.2 卵巢上皮性癌体系细胞突变的转换与颠倒 嘌呤变嘌呤或嘧啶变嘧啶称为转换，嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤，即异型碱基的置换称为颠倒。分析TCGA卵巢上皮性癌样本SNP时，借助titv函数将SNP分类为转换与颠倒，汇总数据展示为箱线图(图3)：显示6种不同转换的总体分布，其中C>T所占百分比最高(35.19%)，每个样本中的转换比例展示为堆积条形图，转换与颠倒的比例相当。
图1 TCGA卵巢上皮性癌体细胞突变队列概述
图2 瀑布图展示TCGA卵巢上皮性癌样本TOP50体细胞突变图谱
2.3 卵巢上皮性癌体细胞突变的超突变分析 超突变分析的瀑布图每个点都是根据SNV类编码的突变颜色，变点法鉴定的超突变基因组片段用黑色箭头突出显示，展示超突变的基因组区域(Kataegis位点)。411例TCGA卵巢上皮性癌样本中，瀑布图未识别出超突变基因组区域。
2.4 卵巢上皮性癌体细胞突变的信号通路富集分析 通路富集分析发现，主要富集于RTK-RAS、NOTCH、WNT、PIK3、Hippo、Cell-Cycle、MYC、TP53、TGF-Beta、NRF2信号通路。上述富集的通路中占比较高的为RTK-RAS和Hippo信号通路，突变样本占比分别为190/411和147/411。
2.5 卵巢上皮性癌TOP50体细胞突变基因协同和互斥分析 对TOP50基因的互作关系进行分析，绝大部分基因是共同发生(协同性)，TP53与DST存在高度协同性(P<0.05)，MDN1与FGL2存在高度互斥性(P<0.05)(图4)。
图3 TCGA卵巢上皮性癌样本中SNV分布的转变和颠倒图
图4 TCGA卵巢上皮性癌样本TOP50突变基因相互关系
共现和排他的基因对表现为三角矩阵，绿色:协同，黄色：互斥
目前卵巢上皮性癌的规范化系统治疗方案主要依赖于满意的卵巢肿瘤减灭术及以铂为基础的化疗，但在12～18个月多数患者出现复发或耐药[6]。靶向治疗是肿瘤精准治疗时代的选择之一。近几年抗血管生成药物、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂(PARPi)等分子靶向药物用于卵巢上皮性癌的维持治疗，改善患者无铂间期或无化疗间期。恶性肿瘤发生发展的规律是“突变-选择-适应”，体细胞突变基因经历这个自然规律演变成恶性肿瘤[7]。目前体细胞突变研究仍以实体瘤活检为主，实体瘤活检这种有创性操作限制了反复取材，当研究ctDNA液体活检时，ctDNA的体细胞突变检测表现出与组织活检相似效用，甚至ctDNA能发现更多可靶向基因的突变[8]。
3.1 卵巢上皮性癌体细胞突变图谱 maftools-R可有效地汇总、分析和可视化TCGA卵巢癌MAF格式的文件。本研究结果表明，错义突变、SNP和C>T突变是卵巢上皮性癌中最常见的突变形式。既往研究已证实，错义突变和SNP在卵巢癌的发生、进展和预后中具有重要意义[9]。3个最常见的突变基因是TP53(91%)、TTN(28%)、FLG2(10%)，TP53基因突变仍是目前癌症基因组中最常见的基因组事件，在卵巢上皮性癌的突变频率很高(50%～100%)[10]。卵巢高级别浆液性腺癌(high-grade serous ovarian carcinoma，HGSOC)中TP53突变频率高达100%[11]。已有研究表明，通过卵巢上皮性癌ctDNA检测TP53预测患者预后有积极意义[12]。TTN基因编码肌联蛋白的作用能调节肌肉的被动弹性，TTN的突变常在实体肿瘤中检测到。研究表明，卵巢上皮性癌中TTN与卵巢上皮性癌进展相关[13-14]。有研究通过多组学分析显示，卵巢上皮性癌中FLG2、TTN等突变影响KIF23表达，KIF23在卵巢上皮性癌中高表达提示预后不良[15]。
3.2 卵巢上皮性癌与RTK-RAS、Hippo信号通路的关系 本研究通过通路富集分析发现，RTK-RAS(190/411)及Hippo(147/411)信号通路是对样本影响的占比最高的两条信号通路。在正常细胞中，Hippo信号通路上游膜蛋白受体感受到胞外生长抑制信号，则激活一系列激酶级联磷酸化反应，使磷酸化下游效应因子YAP和TAZ，抑制YAP/TAZ活性从而抑制细胞增殖。Hippo效应因子YAP是上皮性卵巢癌中过度表达的致癌基因[16]。Fan等[17]研究发现，鞘氨醇磷酸盐通过抑制Hippo信号通路，促进卵巢癌细胞的增殖。SGK3在卵巢癌细胞中高表达，而miR-144-3p低表达，miR-144-3p过表达靶向抑制SGK3通过激活Hippo信号通路来抑制卵巢癌细胞的生长、增殖和侵袭[18]。
影响RTK/Ras信号通路的突变可导致许多人类综合征和疾病，包括癌症。Taylor-Harding等[19]对周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKi)耐药的HGSOC细胞的研究表明，其耐药机制主要是由于RTK/RAS信号通路通过激活E2F和ETS导致对CDKi的耐药。有研究对卵巢透明细胞癌(ovarian clear cell carcinoma，OCCC)肿瘤组织样本和匹配的血液样本进行全基因组测序，结果提示RTK/RAS信号通路的激活与患者的OS升高显著相关，多元分析提示激活RTK/RAS信号通路是OCCC患者的独立预后因素[20]。
3.3 卵巢上皮性癌体细胞突变的协同作用 研究认为，肿瘤的发生是体细胞突变导致，假设突变累积越多，则肿瘤发生及发展越快，但基因组测序结果显示，失调通路中的多数致病的关键基因通常以相互排斥的方式发生突变。单个驱动突变基因发生可促进肿瘤的发展，两个驱动突变基因同时发生反而抑制肿瘤的发展。驱动基因间也会存在协同模式，两个协同的驱动突变突变同时发生可共同促进肿瘤的发展。因此，分析突变基因的协同互斥模式，揭示相似肿瘤产生的重要功能性体细胞突变，识别肿瘤亚克隆特异性的突变基因，可揭示肿瘤发生的新途径和潜在机制。Maftools的体细胞互作功能可识别协同或互斥的突变基因，本研究通过Maftools可视化卵巢上皮性癌TOP50差异基因的协同互斥分析，结果表明绝大部分基因是共同表达、共同发生的。
本研究借助于TCGA数据库，完成了卵巢上皮性癌组织样本体细胞突变普分析、超突变分析及KEGG通路挖掘等，为卵巢上皮性癌发生机制研究提供了一些参考与借鉴，这些研究将促进对癌症病因学的理解，并对预防和治疗具有潜在意义，也为后续卵巢上皮性癌ctDNA体细胞突变研究提供参考。
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