柯永庆 袁 红 汤志成 石尖
（东莞市公安局刑警支队，广东 东莞523008）
在法医DNA 检验工作中，混合斑中精子细胞的分离一直是DNA 检验工作中的重点和难点。目前，实验室常用的方法主要有差异裂解法、滤膜法、细胞分选法、免疫磁珠法［1］等，这些方法均需要手工进行处理，分型成功率很大程度受检验人员的经验、水平等主观因素影响，且耗时较长，需要实验人员全程跟踪进行操作，难以实现批量化的提取纯化。随着全自动核酸提取工作站的投入使用，利用工作站实现对混合斑中精子细胞DNA 的全自动化批量提取，将有助于提高工作效率。
1.1 样本
日常受理的案件中，各类疑似混合斑检材241 份，依据 《GA/T766-2020 人精液 PSA 检测金标试剂条法》进行检验，结果为阳性（含弱阳性）88例、结果为阴性153例，如表1所示。
表1 检材类型和数量
1.2 主要仪器和试剂
X-Pure 96 Plus 硅磁一体微量DNA 提取定量工作站（广州高盛）、混合精斑DNA 磁珠纯化试剂盒（8/16/24 人份，广州高盛）、Power⁃Plex®18 System 扩增试剂盒 （Promega 公司，美国）、ABI Veriti 型扩增仪（AB 公司，美国）、ABI 3500XL 型全自动荧光分析仪（AB 公司，美国）。
1.3 精子细胞DNA的分离提取
剪取适量检材放入“混合精斑DNA 磁珠纯化试剂盒”中专用裂解板的相应孔位，每孔加入TNE 溶液450uL，插入人精液PSA 检测金标试剂条，待获得结果后将试剂条丢弃，随后每孔手工加入SDS 溶液40uL、PK 溶液40uL。将该装有检材和试剂的专用裂解板以及“混合精斑DNA 磁珠纯化试剂盒”中的其他相关耗材放入“X-Pure 96 Plus 硅磁一体微量DNA 提取定量工作站”相应指定位置，启动工作站，设定洗脱体系为50uL，自动运行3.5h 获得精子细胞DNA模板和女性成分DNA模板。
1.4 STR复合扩增及分析
使 用 PowerPlex®18D System 试 剂 盒 在 ABI Veriti 型扩增仪（AB 公司，美国）上扩增。反应总体系10uL，其中DNA 模板2uL、Primer Pair Mix 2uL、Master Mix 2uL、纯水4uL。扩增循环次数为28 次，用3500XL 分析仪（AB 公司，美国）对扩增产物进行毛细管电泳分离，使用GeneMarker Forensic V1.9 软件进行数据分析。
2.1 检验结果
依据行业标准《人类DNA 荧光标记STR 分型结果的分型及应用》（GA/T 1163-2014）相关要求，峰高大于100 相对荧光单位，检出17 个以上STR 基因座和Amelogenin 基因座标记为检出，检验结果如表2、表3所示。
表2 PSA为阳性(含弱阳性)检材检验结果
表3 PSA为阴性检材检验结果
从表2可看出，88例PSA 为阳性(含弱阳性)的检材中，检出单一男性分型有56 例，约占63.6%；
检出混合分型有23例，约占26.1%；
未检出分型的有9 例，约占10.2%。其中，对23例检出混合分型的检材采取手工提取纯化，21例仍检出混合分型，约占91.3%；
1 例未检出分型，约占4.3%；
1 例检出单一男性分型，约占4.3%。对9 例未检出分型的检材采取手工提取纯化，8 例仍未检出分型，约占88.9%；
1 例检出分型，约占11.1%。
从表3 可看出，153 例PSA 为阴性的检材中，检出单一男性分型有16 例，约占10.5%；
检出混合分型有8 例，约占5.2%；
未检出分型有129 例，约占84.3%。其中，对8 例检出混合分型的检材采取手工提取纯化，7 例检出仍检出混合分型，占87.5%；
1 例检出单一分型，占12.5%。未对129 例未检出分型的样本进行再次检验。
2.2 讨论
2.2.1 方法的选择
混合精斑的提取纯化，目前实验室主要采用的方法主要有差异裂解法、滤膜法、免疫磁珠法、细胞分选法等，其各自的优缺点如表4所示，因成本等客观问题，免疫磁珠法、细胞分选法较少运用于实验室检验。
表4 常见提取方法的优缺点
差异裂解法作为提取实验室常用方法，有着成本低廉的优点，且对条件较好的混合斑检材能够有效去除女性成分，获得男性的准确分型。但对于微量、陈旧或精子相对含量较少的检材，可能因消化不完全或者过度消化，导致精子DNA 损失。精子细胞一般头部长3.0～5.0µm、宽2.0～3.0µm、厚1～2µm，尾部长40～60µm［2］。利用孔径为1µm的硝酸纤维素膜，根据分子筛原理，当消化后的混合液体流经内管后，未被消化的精子细胞经过滤被拦截在尼龙膜内，女性上皮细胞DNA 成分溶液穿过尼龙膜进入外套管内，从而达到物理分离精子细胞的目的。
精子细胞膜富含硫醇蛋白，需在二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、β-巯基乙醇等还原剂的作用下才能打开其中的二硫键，从而破膜释放DNA。结合差异裂解法和滤膜法特点，采取“多重裂解滤膜的方法”（见图1）。利用独特配方的裂解液（能彻底消化精子外细胞且不损伤精子细胞）将混合斑中的精子团裂解分离成单精子细胞，采用特殊孔径滤膜，可以有效截留精子，去除非目标残余DNA 的干扰，从而提高精子回收率，并避免了消化不完全或者过度消化导致的精子DNA损失。
图1 多重裂解滤膜法
女性阴道分泌物成分复杂，往往混有大量女性白带物质和肠道细菌等，其中有些成分是扩增抑制物，利用磁珠不吸附除DNA 外的其他杂质，既实现对精斑DNA 的半定量，又去除了PCR 抑制物的干扰作用，从而获得DNA 的优化分型［3］。
综上所述，利用混合精斑全自动提取试剂盒（8/16/24 人份）在X-Pure 96 Plus 硅磁一体微量DNA 提取定量工作站可实现批量化全自动提取，基本实现无需进行手工操作和人工干预跟踪，实验效果与手工提取大致相同，极大地提高了工作效率。
2.2.2 存在不足及改进方向
从图1 可直观看出，多重裂解滤膜法在整个实验过程中，检材载体一直没有去除，最终与截留的精子细胞一同进行裂解，该做法可保证精子细胞不会丢失，提高了男性DNA 的检出率，但由于没有丢弃检材载体，导致检材载体上的女性成分消化不完全，导致检出混合分型的概率大大提高。实验表明，混合斑中男女比例达到1∶100 时，即使是经过改进的裂解法，其成功率也只有20%［4］。从表2 中可以看出：采取多重裂解滤膜方法，PSA 为阳性（含弱阳性）的检材检出男女混合的概率为26%。下一步实验需要注意以下几点，一是通过优化实验步骤，实现在实验过程中丢弃已分离精子细胞的检材载体，从而提高检出单一的概率；
二是通过优化试剂，使试剂更温和有效，实现完全消化女性成分的同时不会导致精子细胞DNA 的丢失；
三是通过优化实验模块，实现由全自动工作站进行PSA 确认实验，进一步提高工作效率。