徐梅,李政权,田仁奎,张显强*
贵州8种杜鹃花属植物的花粉形态及计量分析
徐梅1,李政权2,田仁奎3,张显强1*
1. 贵州警察学院, 贵州 贵阳 550005 2. 贵州泰若数字科技有限公司, 贵州 贵阳 550081 3. 贵州省公安厅物证鉴定中心, 贵州 贵阳 550005
本文以贵州毕节百里杜鹃为采集地，采集马缨杜鹃、迷人杜鹃等8种杜鹃属为实验材料，通过扫描电镜观察花粉的形态及外壁纹饰，并利用SPSS软件对其进行量化分析，可为杜鹃花属植物的分类鉴定和识别提供基础的参考数据。8种杜鹃花属植物的花粉均为四合体花粉，呈正四面体排列，具三孔沟，其中百合花杜鹃和毛杜鹃的形状呈扁球形，其他杜鹃属介于近球形与球形之间，表面附着粘丝情况不一。经SPSS软件量化，结果表明：（1）8种杜鹃属的极轴长、赤道轴长、四合体直径、周长、面积、萌发孔长、萌发孔宽的平均值范围分别为（13.81～21.21）µm，（17.02～29.96）µm，（28.35～42.75）µm，（101.93～170.25）µm，（673.24～1648.76）µm2，（7.67～16.59）µm，（0.57 ～1.77）µm，P/E的范围为0.684～0.839；
（2）对极轴长、赤道轴长等指标进行相关性分析，极轴长、四合体直径、面积是最能影响花粉形态的指标，萌发孔宽指标对花粉形态无显著影响；
（3）主成分分析极轴长、四合体直径、面积组成的因子成分可替代以上8个指标，且贡献率排名为极轴长、四合体直径、面积，可以花粉极轴长、四合体直径、面积因子成分作为分类鉴别的依据之一；
（4）聚类分析显示欧式距离10时可将8种植物分为3类，这与主成分分析的结果相对应。综上，将电镜观察花粉形态的定性方面与SPSS软件定量分析结合为分类鉴别提供了参考价值。
杜鹃花属; 花粉形态; 计量分析
杜鹃花科包括5个属，其中最大的属就是杜鹃属，有近千种[1]。杜鹃是常绿或落叶灌木，稀为乔木，耐寒耐旱，适应性强，喜酸性土壤，多生于林下、林缘、灌丛中。杜鹃种类繁多，西南地区分布较广，它不仅具有较大的观赏性而且大部分为蜜源植物，具有较高的养蜂价值。由于杜鹃属植物的种类繁多，形态各异，植物分类纷繁复杂，且变异性较大，因而前人从活力、分类学等不同方面对该属植物进行较为深入的研究[2,3]。
随着孢粉学的发展，从大量的花粉资料显示，植物系统分类的根本依据之一就是从花粉形态特征出发，但花粉形态特征只能从定性方面去确定，定量方面确定的报道极少。此前就有刘林等[4]对藏东南18种杜鹃属植物花粉形态进行比较，指出花粉形态及大小、萌发孔沟、外壁纹饰等特征，可以作为植物分类研究及系统发育研究的辅助手段。郝佳波等[5]对木兰科16种含笑属植物的花粉形态进行研究，发现极轴长这一性状比赤道轴长和/(轴比)更具有种间分类的价值。Wrońska-Pilarek D等[6]从黑樱草花粉形态及变异进行研究，分析了花粉粒的8个定量特征和3个定性特征，这些特征可以作为区分样本组的辅助手段，其还指出花粉粒性状与采集地点的地理位置有显著的相关关系。本文利用扫描电子显微镜和对SPSS软件对8种杜鹃属进行花粉形态观察和统计分析，从定性与定量的双重角度研究杜鹃属植物资源分类的情况，进而用统计分析的方法去佐证花粉形态特征在分类学上的实用性，为杜鹃花科的分类学研究提供孢粉学证据。
1.1 材料处理
该文的实验材料均来自贵州毕节百里杜鹃自然保护区，共采集8种植物花粉，每种采集1至2个样本并编号分类。将花药从样本取出放至FAA固定液中固定16h- 20 h，将固定好的材料转至不同浓度下的乙醇进行梯度脱水，具体脱水梯度为50%→65%→80%→95%→100%,各级脱水时间为1.5 h。脱水后的材料经自然阴干后用无菌刀对花药切割取出花粉，花粉放至粘有导电胶的样品台上，后经离子溅射仪喷金（E-1010）、镀膜处理，然后通过电子扫描电镜(日立SU-3500)进行观测。
1.2 方法
通过电子扫描电镜(日立SU-3500)对8个样本观测，每个样本选取15粒花粉，对电镜观测下的不同倍数花粉拍照保存。选出清晰品相好的花粉区域照片经Photoshop进行处理(主要是处理花粉粒与花粉粒之间的粘丝)，用Imagepro-plus对处理后的花粉照片进行测量分析，测量出每种花粉的极轴长、赤道轴长、四合体直径、周长、面积、萌发孔长、萌发孔宽共7个指标。用SPSS软件对以上7个定量指标进行相关性分析，相关性分析是根据皮尔逊公式评估的。通过SPSS软件对极轴长、赤道轴长、/、四合体直径、周长、面积、萌发孔长、萌发孔宽8个定量指标的平均值进行主成分分析和聚类分析，通过主成分分析法可以从多指标向少数综合指标的转换。聚类方法采用组间连接，聚类单元之间的遗传距离以平方欧式距离计算，聚类图选用谱系图。
2.1 花粉形态特征
如图1所示，8种杜鹃花的花粉形态呈正四面体排列，四合体具有三孔沟，单粒花粉轮廓呈扁球形或介于近球形与球形之间（图1，表1）。花粉粒表面出现不同程度的粘丝。在扫描电镜的观测下，外壁纹饰大多为突起或呈颗粒状的图案，外壁轮廓线呈微波浪形，极少数为脑纹状纹饰：由脑纹的弯曲短条纹组成，轮廓线为低平的波浪线。花粉粒呈现大、中、小不同程度的颗粒、裂纹等不同纹饰。花粉粒四分体因种类的不同导致饱满程度各异，大多数的花粉呈现出活力饱满的状态，但极少数的花粉粒表现出皱缩的形态，花粉粒的4个面有不同程度的凹陷，有些花粉粒已经呈干瘪、皱缩状，这是由于花粉粒失去了活力[2]，王玉国等[10]研究的花粉形态也出现类似情况，如马缨杜鹃、毛杜鹃、比利时杜鹃（西鹃）已经有不同程度的向内凹陷。本文对花粉的描述性术语遵循Erdtman G等[7]孢粉学手册和王开发等[8]孢粉学概论的专业术语。
图 1 花粉形态的电镜观察
注：1.映山红；
2.百合花杜鹃；
3.马缨杜鹃；
4.迷人杜鹃；
5.腺果杜鹃；
6.大白杜鹃；
7.毛杜鹃；
8.比利时杜鹃（西鹃）。
a.为花粉整体，百合花杜鹃（2）和大白杜鹃（6）标尺为30 µm,其余均为20 µm；
b.外壁纹饰，标尺均为10 µm.
2.2 花粉大小特征
8种花粉极轴长、赤道轴长、四合体直径、周长、面积、萌发孔长、萌发孔宽的平均值范围分别为（13.81～21.21）µm，（17.02～29.96）µm，（28.35～42.75）µm，（101.93～170.25）µm，（673.24～1648.76）µm2，（7.67～16.59）µm，（0.57～1.77）µm，P/E的范围为0.684～0.839，见表1。8种杜鹃花的大小以四合体直径的长度来划分，根据王开发等[8]描述的孢粉大小可将其大小划分为中等等级（25～50）µm，8种花粉的四合体直径范围为（28.35～42.75）µm，在周英兰等[9]研究的杜鹃花四合体直径范围内，其研究的四合体直径范围为(24.8～60.1) µm，基本是吻合的，但8种花粉的大小仍存在着差异。在观测到的8种杜鹃花中，毛杜鹃的大多数指标数据都比较小，比利时杜鹃（西鹃）的四合体直径、面积、萌发孔长、萌发孔宽平均值是最大的。从表1各项指标可以看出，8种不同花粉形态指标之间均存在差异。
表 1 花粉形态特征
2.3 统计分析
2.3.1 相关性分析花粉形态的7个定量指标之间的相关性分析结果见表2，从表中可以看出，萌发孔宽与其他指标无显著相关性，极轴长与其他指标有显著或极显著的相关性（除了萌发孔宽），赤道轴长与萌发孔宽、周长无相关性，与其他4个指标都有极显著的相关性，四合体直径与极轴长、赤道轴长、面积、萌发孔长有极显著或显著的相关性，周长与极轴长有显著的相关性，面积与极轴长、赤道轴长、四合体直径、萌发孔长有极显著或显著的相关性，萌发孔长与极轴长、赤道轴长、四合体直径、面积有极显著或显著的相关性。综上所述，其中极轴长、四合体直径、面积是最能影响花粉形态的指标，萌发孔宽指标对花粉形态无显著影响。
表 2 观测指标之间的相关性
注：“**”和“*”分别表示在0.01水平（双侧）和0.05水平（双侧）上显著相关。
2.3.2 主成分分析对花粉形态的8个定量指标进行主成分分析，旋转方法为凯撒正态化最大方差法，分析结果见图2。从图中可以看出提取的2个主成分累积的贡献率为83.4%，即这2个主成分集中了8个原始指标83.4%的信息。此外，图2显示极轴长、四合体直径、面积组成的因子成分可替代以上8个指标，且贡献率排名为极轴长、四合体直径、面积，表明极轴长在所有的指标中所起的作用是最大的。此目的是表示主成分与每个杜鹃属的关系，因此我们可以从定量的角度通过主成分鉴别每一个孢粉属。
图 2 旋转后的空间成分分布图
2.3.3 聚类分析利用SPSS软件对花粉8个定量特征进行聚类分析，在欧式距离10处，将所有的杜鹃属分为3个组群。毛杜鹃和比利时杜鹃（西鹃）单独为一组，而第二组包括所有杜鹃资源,并分为两个亚组：A亚组为百合花杜鹃，大白杜鹃；
B亚组为映山红，腺果杜鹃，马缨杜鹃，迷人杜鹃。
比较谱系图分类结果与花粉形态特征极轴长、四合体直径、面积三个指标数据，单独为一组的毛杜鹃极轴长、四合体直径、面积分别为13.81 µm，28.35 µm，673.24 µm2。在8种杜鹃属指标数据中最小。单独为一组的比利时杜鹃（西鹃）极轴长、四合体直径、面积分别为21.21 µm，42.75 µm，1320.17 µm2，在8种杜鹃属指标数据中最大。这与主成分分析的结果相对应，进一步印证极轴长、四合体直径、面积综合因子成分从定量上作为鉴别每一个孢粉属的有利依据。
图 3 基于花粉形态特征的杜鹃资源谱系图
3.1 花粉的形态特征
通过对8种杜鹃属植物的花粉形态特征进行扫描电镜观察发现，马缨杜鹃、毛杜鹃、比利时杜鹃（西鹃）处于花蕾膨大期[11]，花粉形状初具四合体，每分体呈现不同程度的凹陷。对每种杜鹃属植物的各项指标测定，其具有不同程度的差异，其中/、形状等指标与前人研究的结果有差异。周英兰[9]、刘林[4]、王玉国[10]等研究的杜鹃属植物花粉形状基本为近球形或球形，且其并未测定/值，由王开发的孢粉学概论描述，花粉形态的确定是由/值确定，因而周英兰[9]、刘林[4]、王玉国[10]等研究的杜鹃属植物形状是否正确有待考究。该文中测定/值范围（0.684～0.839）与Sarwar AKMG等[12]研究的结果大致一致，百合花杜鹃和毛杜鹃的形状为扁球形，其他杜鹃属介于近球形与球形之间。
3.2 统计分析
选用8种定量指标对花粉粒进行了特性研究。对所研究指标进行统计分析，结果表明，四合体直径、面积两个指标在每种杜鹃花之间具有显著性。相关性分析显示，有22个相关系数显著，其中极轴长、四合体直径、面积是最能影响花粉形态的指标，萌发孔宽指标对花粉形态无显著影响。主成分分析显示，极轴长、四合体直径、面积对应的散点在组内呈现相互聚集的情况，表现出相似性，而其他指标对应的散点较分散，表现出差异性。通过主成分分析法对8个指标进行降维，从而得到极轴长、四合体直径、面积成分指标来实现杜鹃属植物的区分。聚类分析显示，在欧氏距离为10处，毛杜鹃和比利时杜鹃（西鹃）与其他杜鹃植物聚类不同，其各自聚为一类，两者之间表现出很大的差异类别，可作为甄别、鉴定杜鹃属植物种属的参考方法。
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Pollen Morphology and Quantitative Analysis of Eight Species ofin Guizhou
XU Mei1, LI Zheng-quan2, TIAN Ren-kui3, ZHANG Xian-qiang1*
1., Guiyang 550005,2., Guiyang 550081,3.,550005,
Eight species ofsuch asandFranch were collected as experimental materials in Bijie, Guizhou. The morphology and outer wall decoration of pollen were observed by SEM, and the quantitative analysis was carried out by SPSS software, which can provide basic reference data for the classification and identification of. The pollens of eight species ofare all tetrazygous pollens with tetrahedral arrangement and three furrows.andare oblate spherical in shape, while otherare between subspherical and spherical, with different adhesion and adhesion on the surface. Quantified by SPSS software, the results show that: (1) The average values of polar axis length, equatorial axis length, pollen diameter, perimeter, area, germinal apertures length, and germinal apertures width of the eightwere (13.81-21.21) µm, (17.02-29.96) µm, (28.35-42.75) µm, (101.93-170.25) µm, (673.24-1648.76) µm2, (7.67-16.59) µm, (0.57-1.77) µm, respectively. P/E range is 0.684-0.839. (2) The correlation analysis of the polar axis length and equatorial axis length showed that the polar axis length, the diameter and the area of the tetrazygote were the most influential indicators of pollen morphology, while the germinal apertures width had no significant effect on pollen morphology. (3) The results of PCA showed that the factor components composed of polar axis length, tetrazygote diameter and area could replace the above eight indexes, and the contribution rates were ranked as polar axis length, tetrazygote diameter and area, indicating that polar axis length, tetrazygote diameter and area factor components could be used as one of the basis for classification and discrimination. (4) Cluster analysis showed that eight species could be divided into three groups at Euclidean distance of 10, which corresponded to the results of PCA. In conclusion, the combination of qualitative aspects of pollen morphology observed by electron microscopy and quantitative analysis by SPSS software provides reference value for classification and identification.
; pollen morphology; statistical analysis
Q944.6
A
1000-2324(2022)06-0925-05
2022-05-02
2022-06-13
贵州省教育厅青年科技人才成长项目:贵州有毒蜜源植物调查及其花粉显微形态观测研究(黔教合KY字[2021]283)
徐梅(1990-),女,硕士研究生,讲师,研究方向:计算物理、生物物理. E-mail:xumei684719@163.com
Author for correspondence. E-mail:zhangxianqiang@126.com
10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.018
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