王月桂，洪理伟，吕国荣，杨舒萍，李 玲，黄学鹏，沈浩霖
1福建医科大学第三临床医学院，福建 福州 320000；
福建医科大学附属漳州市医院2超声科，3核医学科，福建漳州 363005；
4泉州医学高等专科学校，福建 泉州 362000
甲状腺功能亢进（甲亢）的发病率约为1.2%［1,2］。约有70%～85%的甲亢是由Graves病（GD）所引起［3-5］。放射性131I治疗可以快速缓解患者的甲亢症状，被视为当前治疗GD的有效手段［6-8］。但仍有8%～50%的患者面临治疗后甲亢未愈或复发需要二次治疗的问题［9,10］。影响GD患者131I治疗结局的相关因素一直受到关注［11-14］。既往研究表明，Ki67 可以反映细胞增值的情况［15,16］。Domoslawski等［17］认为GD患者滤泡上皮细胞Ki67 表达水平明显高于结节性甲状腺肿患者，Jessica等［18］的研究表明接受β受体阻滞剂治疗的GD 患者Ki67表达减少。然而，GD患者滤泡上皮细胞Ki67 表达水平是否与131I治疗结局相关以及能否作为反映治疗反应性的指标，尚未见报道。本研究旨在联合应用超声新技术，分析与甲亢未愈或复发相关的因素，了解甲状腺滤泡上皮细胞Ki67表达与甲亢未愈或复发的关系。
1.1 研究对象
选取2020年1月～2021年11月在我院核医学科就诊的GD患者112例，年龄18～72岁。研究截止时间为2022年1月24日。
纳入标准：（1）符合GD诊断标准［19］；
（2）无放射性131I治疗禁忌证；
（3）131I 治疗相关资料、病理资料及随访资料完整。排除标准：（1）有甲状腺手术史；
（2）非首次接受131I治疗；
（3）伴发甲状腺恶性肿瘤者；
（4）病理资料不完整，未获得Ki67结果；
（5）研究截止时间到，服药后未满1年且未出现相关事件。
排除患者23例，其中12例为非首次接受131I治疗；
11例为研究截止时间到，服药后未满1年且未出现相关事件。最终纳入患者89例，男性22例，女性67例，年龄45.0±14.0岁。
所有受试者均知情同意并签署书面同意书。本研究得到福建医科大学附属漳州市医院伦理委员会的批准（No.2020KYB138）。
1.2 131I治疗后随访时间及结局事件定义
每位患者最长随访时间为1年，治疗后1个月为随访开始时间。随访终止有以下3种情况：（1）患者每种事件首次出现的时间；
（2）随访时间满1年；
（3）研究截止时间到。根据随访结果，结局分为甲亢未愈或复发（事件1）、早发甲状腺功能减退（早发甲减）（事件2）及甲状腺功能正常或失随访（删失）3种。
1.3 Ki67结果
甲状腺组织细针抽吸活检术后，穿刺物应用罗氏全自动免疫组化仪进行细胞增殖指数Ki67染色，在显微镜（目镜直径为22 mm）高倍镜（×400）下观察。以每视野中≥200 个细胞为合格标本，镜下观察切片：（1）镜下细胞较多或存在明显Ki67 热点的切片，选取2～3 幅包含阳性率最高区域的视野计数；
（2）镜下细胞较少或无明显Ki67 热点的切片，选取包含切片中全部滤泡细胞的视野。Ki67 增殖指数=Ki67 阳性核的滤泡细胞数/滤泡细胞总数×100%。根据Ki67 增殖指数分为：Ki67表达阴性（增殖指数＜1%）、Ki67表达阳性（增殖指数≥1%）。
1.4 相关因素
1.4.1131I治疗剂量 用计算剂量法确定131I给药剂量，即根据甲状腺质量和甲状腺摄131I率（RAIU）进行计算［19］。每克甲状腺组织的剂量范围为80～150 uCi。口服131I活度(uCi)=[计划量(uCi/g)×甲状腺质量(g)]/[最高RAIU或24h RAIU(%)]。摄碘率的计算采用以下公式：RAIU=[甲状腺部位计数率（计数·min-1）-本底（计数·min-1）]/[标准源计数率（计数·min-1）-本底（计数·min-1）]×100%。
1.4.2 甲状腺三维容积 使用GE LOGIQ E8的超声诊断仪，三维容积探头RAB-6。由上至下横切扫查甲状腺，选取最大横切面后固定探头，启动三维超声体积自动测量技术对甲状腺进行自动图像采集并存储，设备自动重建甲状腺模拟模型并计算体积（cm3），从而获得甲状腺的三维容积。
1.4.3 甲状腺腺体剪切波弹性速度值 使用SEMENS ACUSON Sequoia 512的超声诊断仪，10L4相阵探头。进入弹性成像模式，选取一侧甲状腺最大纵切面，避开血管和结节，待图像稳定后定帧，在腺体中央由距上极5 mm处开始测量，每隔5 mm测一次，总共测3次，平均值为一侧甲状腺剪切波弹性速度值；
同样的方法测量另一侧甲状腺，双侧平均值即为该患者甲状腺剪切波弹性速度值。
1.4.4 游离甲状腺素（FT4）和游离三碘甲状原胺酸（FT3），血清促甲状腺激素受体抗体（TRAb）水平 使用电化学发光免疫测定法（贝克曼，DXI800，美国）测量患者空腹过夜后静脉血的FT3、FT4及TRAb水平。FT3正常范围为3.10～6.80 pmol/L；
FT4 正常范围为7.5～21.1 pmol/L；
TRAb正常范围为＜1.75 IU/L。
1.4.5 患者临床资料 记录患者年龄、性别、甲亢病程、131I治疗前是否服用过抗甲亢药物（ATD）。
1.5 统计学处理
统计学分析采用R version 4.0.5（http://www.rproject.org/）。经Kolmogorov-Smirnov正态性检验，本研究中年龄呈正态分布，以“均数±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析；
其它连续性变量为非正态分布，以Median[Q25，Q75]”表示，组间比较采用秩和检验；
分类变量以“例（率）”表示，组间比较采用卡方检验。对于P＜0.05的非正态分布的连续性变量，进一步采用Nemenyi法进行两两组间比较。
用cmprsk包进行竞争风险回归分析。计算甲亢未愈或复发的风险比（HR）及95%置信区间（CI）。随访时间被用作相应的模型中的时间尺度。根据单变量分析的结果（以P＜0.25为具有统计学意义），多变量模型针对以下变量进行了调整。模型1纳入年龄。为了研究Ki67表达与甲亢未愈或复发之间的关联是否归因于病程、用药史和其它的相关因素，模型2在模型1的基础上进一步纳入了用药史、131I剂量、甲状腺三维容积、甲状腺剪切波速度值及TRAb水平。
2.1 患者基线特征，甲亢未愈或复发的累积风险边缘概率
最终入组患者有89例，其中甲亢未愈或复发27例，早发甲减50例，甲状腺功能恢复正常1例，失随访11例。患者的基线特征见表1，结果显示，患者3组间的甲状腺三维容积存在差异，进一步进行两两组间分析显示，甲亢未愈或复发组的甲状腺容积大于其它两组（P均＜0.05），而早发甲减组与另一组无明显差异；
其余各因素在3组中的分布情况无明显差别（P均＞0.05）。累积风险边缘概率分析显示131I治疗300 d后，甲亢未愈或复发的发生概率约25%（图1）。
表1 89例患者的临床资料Table 1 Clinical data of the 89 patients
图1 Graves病患者131I治疗后发生甲亢未愈或复发及甲减的累积风险边缘概率Fig.1 Cumulative marginal risk probability of unhealed or recurrent hyperthyroidism and hypothyroidism in patients with Graves disease after131I treatment.
2.2 甲亢未愈或复发的相关因素
以早发甲减作为治疗结局竞争事件，在单因素分析结果基础上，模型1纳入年龄后，显示Ki67表达阳性组患者甲亢未愈或复发的风险为表达阴性组患者的0.31倍，HR（95%CI）为0.31（0.13，0.73）。模型2 在模型1的基础上继续纳入用药史、131I剂量、甲状腺三维容积、甲状腺剪切波速度值、TRAb后，Ki67表达阳性组患者甲亢未愈或复发的风险为表达阴性组患者的0.36倍，HR（95%CI）为0.36（0.15，0.86），而131I剂量及甲状腺三维容积的HR（95%CI）分别为0.81（0.68，0.96），1.11（1.07，1.15），P均＜0.05（表2）。
表2 竞争风险模型分析结果Table 2 Results of competitive risk model analysis
131I是目前治疗GD的有效手段［20］。然而，GD患者131I治疗后甲亢未愈或复发仍是临床难题。本研究的累积风险边缘概率分析证实131I治疗300天后，甲亢未愈或复发的发生概率约25%（图1），这部分患者临床症状及相关并发症未能得到理想的控制。131I治疗GD的主要作用机制与肿瘤放射治疗相似，利用射线破坏滤泡上皮细胞，以减少甲状腺激素生成［21,22］。既往的研究认为，患者性别、病程、治疗前是否服用ATD药物治疗等均会影响治疗结局，考虑跟患者甲状腺对131I敏感性不同有关［23-25］。能否评估患者对131I治疗的敏感性并制定相应治疗方案一直是临床关注的重点。Ki67是细胞增殖的标志物，细胞核分裂明显，功能越活跃，Ki67表达水平就越高，主要用来评估肿瘤细胞对治疗的敏感性［26,27］。本研究以接受首次131I治疗的GD患者为研究对象，研究GD患者甲状腺滤泡上皮细胞Ki67表达与甲亢未愈或复发的关系，目前尚未见报道。
早发甲减是131I治疗的重要结局之一，因此本研究应用竞争风险模型进行分析。由于患者给药剂量是基于计划量、摄碘率和有效半衰期等指标计算，因此本研究仅将最终给药剂量纳入分析，以避免相关指标共线性问题。基线资料分析显示甲亢未愈或复发组的甲状腺容积明显较大，提示容积有可能是甲亢未愈或复发的重要因素，应对其进一步分析。与文献报道一致，本研究结果显示131I剂量为甲亢未愈或复发的保护因素，表明治疗剂量越高，患者甲亢未愈或复发发生的危险性越低；
而甲状腺容积为危险因素，容积越大，患者甲亢未愈或复发发生的风险越高，提示治疗前有必要应用容积测量技术对甲状腺容积进行准确测量并调整好131I给药剂量［9,28,29］。
此外，为了验证Ki67 与甲亢未愈或复发的关系，我们构建了不同的模型进行敏感性分析。为了观察人口学特征的影响，模型1首先对年龄进行调整，结果显示，Ki67的HR由0.40下降为0.31，虽然降幅大于10%，但Ki67 与甲亢未愈或复发仍具有直接联系（95%CI为0.13，0.73）。为进一步观察结局是否归因于用药史、131I剂量、甲状腺三维容积、甲状腺剪切波速度值和TRAb，模型2在模型1的基础上进一步对上述因素进行调整，分析结果显示，Ki67和甲亢未愈或复发的关联是独立于其他因素的，表明Ki67的表达与甲亢未愈或复发有直接关系。本研究初步证实甲状腺滤泡上皮细胞Ki67阳性表达的GD患者，甲亢未愈或复发发生的危险性较低。考虑可能的机制为：Ki67阳性表达，细胞处于增殖期，对131I越敏感，细胞破坏越明显［30］。Ki67可以作为反映细胞对131I是否敏感的潜在指标。但纳入样本量偏少是本研究的主要不足之处，在接下来的研究中，我们将进一步扩大样本量并进行多中心研究以进一步验证Ki67与131I治疗结局的关联性。
甲状腺滤泡上皮细胞Ki67表达阳性、131I给药剂量及甲状腺容积与131I治疗后甲亢未愈或复发存在独立关联。超声引导下甲状腺细针穿刺技术及三维容积测量技术可以在GD患者131I治疗中发挥重要作用。
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