■卓微伟 任胜杰 王 笑 顾晓龙 李定刚 谢仁成
（1.江苏医药职业学院药学院，江苏盐城 224005；
2.盐城工学院海洋与生物工程学院，江苏盐城 224051；
3.保定冀中生物科技有限公司，河北保定 071000）
鱼粉是水产养殖动物饲料配方中的重要原料，饲料中鱼粉替代的研究工作一直是水产饲料技术研究的热点[1-2]，尤其是用豆粕等植物蛋白质原料替代鱼粉的研究较多[3]。植物性蛋白质原料部分或全部替代鱼粉后，会导致饲料中营养素不平衡，或因为植物蛋白质原料中抗营养因子等的作用，养殖鱼体出现较为典型的炎症（如肠炎、肝炎等）[4-5]。水产动物研究中发现植物多糖由于其独特的药理特性表现出优异的消除炎症、抗氧化、促进生长性能等功效[6]，因此通过在低鱼粉饲料配方中添加适宜种类和含量的天然植物多糖可能是一种改善高植物蛋白饲料对养殖鱼类的不良生理影响的有效途径。白术多糖是从白术（Atrctylodes macrocephalaKoidz.，白术已列入《饲料原料目录》）干燥根中提取的活性成分。有研究发现，日粮中添加白术多糖具有改善动物肠道健康、促进免疫功能的作用，应用于畜禽生产中能够促进畜禽生长，提高抗病能力[7]。白术多糖也是一种提高免疫功能的免疫增强剂，可通过激活由TLR4介导的TLR4-MyD88/NF-κB以及TCR-NFAT信号通路，调控NF-κB和NFAT的表达，促进细胞因子产生，从而促进巨噬细胞活化[8]。
黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco），又称黄辣丁，属鲇形目（Siluriformes）、鲿科（Bagridae）、拟鲿属（Tachysurus），是我国重要的养殖鱼类品种，据2022年中国渔业统计年鉴最新数据显示，2021年其养殖产量高达58.78万吨。试验通过设计养殖试验来评估饲料中添加白术多糖对因豆粕等蛋白替代鱼粉后黄颡鱼生长性能、脏体指数、体成分、血浆生化以及肝肠形态不良影响的改善效果，研究白术多糖作为饲料功能性添加剂在黄颡鱼中的适宜添加量，研究结果能够为白术多糖作为水产鱼类饲料添加剂的可行性提供一定的参考。
1.1 试验饲料
试验选用鱼粉（智利）、豆粕和菜粕为主要蛋白源，根据黄颡鱼营养需求，参照吕斌等[9]黄颡鱼研究的配方参数，配制粗蛋白含量为42.70%、粗脂肪含量为9.97%的试验饲料。试验中设置含有15%鱼粉的对照组（CON 组）和用豆粕等蛋白替代25%鱼粉的豆粕组（SBM 组），以及分别在CON 组和SBM 组中添加250、500 mg/kg的白术多糖（C250、C500、S250组和S500组）6 组等氮等脂饲料，饲料配方及营养水平见表1。白术多糖（纯度≥98%）由保定冀中生物科技有限公司提供，其他饲料原料由浙江恒兴饲料有限公司提供。饲料原料经充分粉碎过60 目孔径分筛，用制粒机制成3.0 mm的沉性颗粒饲料，70 ℃烘干至水分低于10%，16目筛筛去破碎颗粒，自封袋密封后放入-20 ℃冰箱中储存备用。
表1 饲料配方及营养水平（%）
1.2 试验鱼和管理
试验黄颡鱼幼鱼购自浙江省湖州市南浔苗种场。试验鱼进行两周暂养、驯化，暂养期间每天按照鱼体重的3%～5%、7：30 和17：30 表观饱食投喂对照（CON）饲料两次。停食24 h 后选取720 尾规格一致的黄颡鱼[初均重（10.13±0.26）g]，随机分组并放入容积为600 L的18个循环水养殖桶中，每桶40尾。养殖试验共设6 个处理，每处理3 重复。试验期间每日投喂两次（7：30和17：30），每次投喂至表观饱食，养殖试验共持续56 d。养殖期间，24 h持续微孔增氧，溶氧≥7.0 mg/L。试验用水为经充分曝气48 h 的自来水，试验期间每天监测，水温为24～28 ℃，氨氮≤0.2 mg/L，亚硝酸盐≤0.2 mg/L，pH为7.2～7.5，光照周期为12 L∶12 D（7：30～19：30光亮）。
1.3 样品采集与分析
56 d养殖试验结束后禁食24 h，对每桶试验鱼进行称重，统计每桶鱼的总重和尾数，计算成活率、生长性能、饲料系数等指标。每个组随机选9尾鱼（3尾/桶）用于体成分分析。参照AOAC（2000）中检测方法，分析鱼体、饲料组成成分[10]。通过热干法（930.15）分析干物质，使用Kjeldahl 法（984.13）测定粗蛋白，通过SOXTEC 脂肪分析法（920.39）测量粗脂肪含量，采用105 ℃烘干法测定各组饲料中的水分含量；
550 ℃灼烧法测定各组饲料和鱼体的粗灰分含量。
成活率（%）=100×试验末尾数/试验初尾数
特定生长率（SGR，g/d）=100×（ln 试验末鱼总重-ln试验初鱼总重）/养殖天数
饲料系数（FCR）=饲料消耗量（g/桶）/鱼体增重量（g/桶）
每桶随机捞取5尾鱼（每组15尾）立即放入200 mg/L的MS-222 中深度麻醉处理后，称取5 尾鱼体重后用1 mL 注射器（管壁用1%肝素钠抗凝剂润湿）尾静脉采集全血，血样在4 ℃冰箱静置2 h后，通过离心分离获得血浆（4 000 r/min，10 min，4 ℃）。血浆在液氮速冻后-80 ℃保存，并在48 h 内完成血浆生化测定。血浆天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（AKP）、白蛋白（ALB）（北京百奥泰康生物技术有限公司），球蛋白（GLB）、总胆汁酸（TBA）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）（宁波美康生物科技股份有限公司），总胆固醇（TC、KyowaMedexCo., Ltd., Tokyo），以上均由Abbott全自动血液生化分析仪（Abbott C8000，U.S.）根据制造商购买比色测试套件的说明测定。
每桶随机选取5 尾黄颡鱼，称取每尾鱼重、测量每尾鱼体长，剖检取内脏团和肝脏、胆囊等脏器称重，并计算脏器指数值。
肥满度（CF，g/cm3）=100×鱼体重（g）/[鱼体长（cm）]3
脏体比（VSI，%）=100×（试验末鱼内脏团重/试验末鱼体重）
肝体比（HSI，%）=100×（试验末鱼肝重/试验末鱼体重）
胆体比（GSI，%）=100×（试验末鱼胆囊重/试验末鱼体重）
每桶随机取3 尾鱼，采集肝脏和中肠（肠道全长的1/2处），进行组织形态病理学检查。分离的肝脏和中肠先在0.65%生理盐水中漂洗，快速洗去血污、粪便等杂质后分别转入4%多聚甲醛溶液固定后制成石蜡切片并进行H.E.组织染色，评估肝脏、肠道组织病理形态变化。
1.4 数据处理
数据以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。经单因素方差分析（ANOVA）分析后，存在显著差异，则进行Duncan’s 多重比较各组间的显著性差异。采用SPSS24.0 软件进行统计计算，统计显著性水平设为P＜0.05。
2.1 白术多糖对黄颡鱼生长性能和饲料利用率的影响（见表2）
由表2可知，SBM组黄颡鱼末均重和SGR显著低于其他5 组（P＜0.05），且CON、C250、C500、S250组和S500 组之间末均重和SGR 差异不显著（P＞0.05）。SBM、S250组和S500组FCR显著高于CON、C250组和C500组（P＜0.05），且S250组和S500组显著低于SBM组（P＜0.05），CON、C250组和C500组间无显著性差异（P＞0.05）。结果显示，饲料中补充白术多糖后可以使SBM组黄颡鱼的生长性能达到其他试验组的水平。
表2 白术多糖对黄颡鱼生长性能和饲料利用率的影响（n=3）
2.2 白术多糖对黄颡鱼体成分的影响（见表3）
表3 白术多糖对黄颡鱼体成分的影响（%，n=3）
由表3可知，各组间试验鱼的体成分没有显著差异（P＞0.05）。
2.3 白术多糖对黄颡鱼肥满度及脏器指数的影响（见表4）
表4 白术多糖对黄颡鱼肥满度及脏器指数的影响（n=15）
由表4可知，SBM、S250组和S500组黄颡鱼的肥满度显著低于CON、C250、C500 组试验鱼（P＜0.05），且S500组肥满度显著高于SBM组（P＜0.05）。SBM组肝体比显著高于其他5组（P＜0.05），此外C500组肝体比显著高于CON、C250组（P＜0.05）。各组脏体比和胆体比均无显著性差异（P＞0.05）。
2.4 白术多糖对黄颡鱼血浆生化指标的影响（见表5）
如表5所示，血浆中AST、ALT酶活性在各组间均差异不显著（P＞0.05）。SBM 组AKP 酶活性显著高于CON、C250、C500、S250 组和S500 组，且其他5 组之间差异不显著（P＞0.05）。SBM、S250组和S500组黄颡鱼血浆中ALB和GLB的浓度显著低于CON、C250、C500组（P＜0.05）。CON、C250、C500 组之间ALB 和GLB 的浓度差异均不显著（P＞0.05）。SBM、S250组和S500组之间ALB 浓度差异不显著（P＞0.05），但SBM 组GLB的浓度显著低于S250组和S500组，S250组和S500组之间差异不显著（P＞0.05）。SBM组和S500组血浆TC浓度显著低于CON、C250、C500 组，且SBM 组同S500组之间及CON、C250、C500 组TC 浓度各自差异均不显著（P＞0.05）。SBM、S250组和S500组黄颡鱼血浆中TBA 的浓度显著高于CON、C250、C500 组（P＜0.05），且SBM 组显著高S250 组和S500 组（P＜0.05），S250 组和S500组之间差异不显著（P＞0.05）。SBM、S250组和S500 组黄颡鱼血浆中TG 的浓度显著低于CON、C250、C500组（P＜0.05），且SBM组显著低于S250组和S500 组（P＜0.05），S250 组和S500 组之间差异不显著（P＞0.05）。SBM 组HDL 的浓度显著低于CON、C250、C500、S250组和S500组，且其他5组之间差异不显著（P＞0.05）。SBM、S250 组和S500 组血浆LDL 浓度显著高于CON、C250、C500 组（P＜0.05），SBM、S250 组和S500 组之间以及CON、C250、C500 组各自3 组之间LDL浓度差异均不显著（P＞0.05）。
表5 白术多糖对黄颡鱼血浆生化指标的影响（n=3）
2.5 白术多糖对黄颡鱼肝肠形态学影响（见图1、图2）
由图1所示，CON、C250、C500组黄颡鱼的肝组织结构正常，肝小叶（HL）和肝窦（HS）结构清晰完整（图1A），视野内肝细胞边界清晰，呈多边形排列紧密，细胞核位于细胞中心（图1A）。SBM、S250 组和S500 组的肝组织结构明显异常，主要体现在肝组织空泡化明显（图1D），此外肝小叶和肝窦结构模糊，难以明确辨识，视野内肝细胞和细胞核轮廓异常，且明显排列无序；
此外，同SBM组相比，S250组和S500组中，S500组肝脏组织形态改善效果更明显。
图1 黄颡鱼肝脏病理切片观察（400×）
由图2可知，CON、C250、C500组黄颡鱼的中肠组织结构正常，未观察到明显的组织病变，中肠肠绒毛形态规则，结构清晰，杯状细胞数量较多。而SBM、S250 组和S500 组的中肠组织结构明显异常，主要体现在肠绒毛空泡化明显，炎性细胞浸润以及绒毛长度明显变短（图2D）。同SBM组相比，S250组和S500组中，S500组肠组织形态改善效果更明显。
图2 摄食不同日粮后黄颡鱼肠道病理形态图（200×）
在本研究中发现等蛋白质豆粕替代25%鱼粉后，黄颡鱼的生长性能显著降低、饲料系数显著升高，肥满度下降，肝体比升高，血浆生化指标异常，肝脏和中肠组织空泡化，肠绒毛高度减小等不良影响，这和研究者在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[11-12]、大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）[13]、鲫（Carassius auratusL.）[14]、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）[15]等鱼类研究中的结果相一致。研究者指出，导致以上不良生长和生理影响的原因可能有两个方面：一方面增加的植物蛋白源中含有较高的抗营养因子，如豆粕中的胰蛋白酶抑制剂、大豆抗原蛋白以及非淀粉多糖等，这些抗营养因子会作用于肠道黏膜、上皮细胞以及通过破坏消化道原有微生物稳态，诱发消化道炎症以及损伤，导致营养物质消化吸收能力降低和生理代谢的减弱，造成生长和生理代谢的不良影响[13]；
另一方面可能是由于豆粕和鱼粉相比部分营养素的缺失以及营养素的不平衡造成，尤其当等蛋白质替代前提下的必需氨基酸平衡性问题。叶元土等[16]研究发现对于黄颡鱼而言，豆粕和鱼粉同黄颡鱼体必需氨基酸相关系数分别为0.74和0.91，表明豆粕中的必需氨基酸同黄颡鱼的真实生理需求存在明显差异，必需氨基酸的缺失和不平衡势必导致了黄颡鱼生长性能的降低和生理代谢的异常。
白术多糖是传统天然植物白术中含有的主要有效活性成分之一，医学以及畜禽相关研究中发现白术多糖具有增强免疫、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤的功效。如在仔猪的相关研究中发现白术多糖能够显著提高平均日增重量，增加肠道益生菌的种类和数量，促进消化能力，改善仔猪肠道内环境[17-19]。此外在禽类（如岭南黄鸡[20]等）研究中发现日粮中添加白术多糖可显著提高其生长性能，显著降低料重比，促进免疫器官发育。在本研究中同样也发现，在豆粕饲料组中添加250 mg/kg和500 mg/kg的白术多糖能显著提升黄颡鱼的生长性能。这些研究结果提示在饲料中添加适宜剂量的白术多糖对畜禽以及鱼类的生长性能具有促进功效。
白术多糖提升畜禽生长性能可能和对肠道和肝脏形态及功能的改善密切相关。白术多糖可显著提高断奶仔猪肠道绒毛高度，改善仔猪肠道微生态区系的多样性，使肠道微生态趋于平衡，进而改善断奶仔猪小肠屏障功能[17，21]。此外，王琳[22]在对育成鸡的研究中也发现添加白术多糖能够改善小肠的形态，显著提高空肠的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度值。这些研究成果提示，白术多糖对肠道的调节作用主要集中于对肠道长度、肠绒毛高度、隐窝深度以及连接蛋白等物理屏障的保护作用，且对肠道菌群具有一定的平衡作用。动物肠道和肝脏之间功能紧密相连，共同构成“肠-肝”轴代谢途径，白术多糖对肠道的调节也会对肝脏产生影响。在本研究中同样发现黄颡鱼豆粕日粮组中添加白术多糖后，肝脏组织的空泡样变损伤明显得到改善，血浆中AST和ALT酶活性升高。研究发现白术多糖对脂肪肝的影响主要是通过脂肪酸运输和载脂蛋白来实现，白术多糖能通过改善肝细胞脂肪变性、空泡样变、肝组织三酰甘油和游离脂肪酸含量，提高血浆中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸转移酶的含量对单纯高脂饮食诱发的非酒精性脂肪性肝炎产生明显的预防作用[23-24]。此外，研究发现白术多糖可以减轻小鼠肝脏的炎症损伤和氧化应激，并在脂多糖（LPS）侵入肝脏的早期发挥保护作用[25]。
血液循环是肠肝功能紧密连接的纽带，肠道消化转运和吸收的营养物质经肝脏代谢合成的功能性物质大部分要通过血液循环来转运。医学临床中，血浆生化指标通常能够快速反映机体的脏器炎症、损伤以及代谢异常。其中AST、ALT、AKP是临床上用来反映肝脏损伤的常用指标。从表5中可以看出，SBM饲料组AKP活性的均值显著升高，提示SBM组肝脏存在一定的损伤，损伤情况在肝体比的显著升高，以及形态学切片观察中也得到了证实。此外血浆白蛋白和球蛋白能够反映血液的渗透压、机体的营养水平和免疫水平。研究中发现SBM组血浆白蛋白和球蛋白浓度均显著低于CON、C250组和C500组，提示了SBM组黄颡鱼血液渗透压的异常、营养不足以及免疫水平的低下；
TC、TBA、TG、HDL和LDL反映了鱼体的血脂代谢情况。研究中发现SBM组血浆TC、TG、HDL浓度显著低于CON、C250 组和C500 组，而TBA、LDL 浓度显著高于CON、C250 组和C500 组，表明摄食豆粕饲料后黄颡鱼血脂代谢的异常，或鱼体脂肪转运储存发生显著改变。研究中发现通过在SBM 组饲料中添加白术多糖后这些不良影响得到了明显的改善，这可能和白术多糖对黄颡鱼肠肝组织的修复，以及肠道微环境的改善有关。
以上结果均表明在黄颡鱼豆粕组饲料中通过添加白术多糖来改善其不良影响是有效的。此外，研究中为了评估持续添加白术多糖的安全性，在CON 组的基础上增设了C250 组和C500 组，同CON 组相比，添加白术多糖组未发现不良影响，表明本研究条件下黄颡鱼饲料中添加500 mg/kg 白术多糖是安全的，同时也发现在对照组中添加250 mg/kg 和500 mg/kg 的白术多糖并未呈现出在豆粕组饲料中的促进生长、改善血浆生化指标及肠肝形态功能，这可能是因为正常生理条件下白术多糖的作用主要体现在健康维护方面，此外还可能存在剂量效应问题，不同日粮条件下白术多糖有效剂量和效果可能是变化的，其效果在营养品质差的日粮中可以表现出来，而日粮营养品质高的时候低剂量效果可能更好，此现象在畜禽研究中也已被发现[7]。
在当前国家对水产养殖业全面禁抗、绿色环保的大环境下，将白术多糖开发成为有效的饲料添加剂产品对扩大和加深天然植物资源的应用范围以及实现水产养殖业的绿色发展具有深远的意义。然而目前白术多糖在水产动物中的相关研究非常匮乏，例如对不同食性鱼类的最适添加量，以及最适添加量和鱼类配方中核心原料组分间的相关性关系及其对鱼类促生长、改善肠肝损伤、生理代谢方面的深层次作用机制仍需进一步探究。
豆粕等蛋白替代25%鱼粉，会引起黄颡鱼生长性能下降、肝体指数和血浆生化指标的异常，此外还会导致肝脏和中肠组织空泡化，肠绒毛高度减小等不良影响；
在高豆粕饲料中添加250 mg/kg和500 mg/kg的白术多糖能明显改善由豆粕替代鱼粉造成的不良影响。在鱼粉对照组饲料中添加250 mg/kg和500 mg/kg的白术多糖未发现不良影响。在本试验条件下，黄颡鱼最适添加含量为500 mg/kg。