韩 勇
（山西药科职业学院，山西太原 030031）
植物挥发油又称为植物精油（王建宝等，2011），是存在于植物中的次生代谢物（何敏等，2015），是一类挥发性油状物质（吴迪等，2018）。植物挥发油已被广泛应用于食品、医药、养殖、日用品等行业（邓永飞等，2020；
陈卫东等，2019；
任澎等，2018；
李冰等，2017）。其中具有抑菌、抗氧化、免疫调节等生物活性的植物挥发油，在食品、饲料等领域呈现出良好的发展潜力（王雪，2021；
李娜等，2021；
汪天龙等，2020）。
水蔓菁（Veronica linariifolia）是玄参科婆婆纳属的全草（李梦等，2019），味苦、性微寒（张子梅等，2011）。水蔓菁在民间有长期广泛的食用和药用习惯（张阜炳等，2019）。现有研究表明，其主要化学组成有挥发油、黄酮类、酚类化合物等成分，其中挥发油是水蔓菁的主要组成成分之一（韩勇，2021）。水蔓菁挥发油具有祛痰、镇咳等活性（李峰，2002）。但目前对于其抗氧化的研究鲜见报道。研究表明，具有抗氧化性的挥发油用于动物养殖生产，可有效降低动物的氧化应激（温鹏飞等，2017）。高油食品及油脂在食用前易氧化、水解而酸败变质，因此需要使用抗氧化剂（周孟倩，2009）。本研究采用超声波法提取水蔓菁中的挥发油成分，运用响应面试验分析方法优化了水蔓菁挥发油的超声提取工艺，并通过测定水蔓菁挥发油的DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、总还原力，对超声波法提取所得挥发油的抗氧化活性进行了评价，旨在为充分有效的利用水蔓菁挥发油资源提供试验参考，并有望成为食品和饲料的新型天然抗氧化剂。
1.1 试验材料 水蔓菁，采于山西省运城市万荣县。无水乙醇、无水硫酸钠、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、抗坏血酸、硫酸亚铁、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等，均为分析纯。
1.2 试验仪器DXF-02C型手提式粉碎机，广州市大祥电子机械设备有限公司；
UV3000型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；
FK124型电子分析天平，北京朗科兴业称重设备有限公司；
TL-650CT多用途恒温超声波提取机，江苏天翎仪器有限公司。
1.3 水蔓菁挥发油提取 使用粉碎机将水蔓菁粉碎成细粉，精确称取10.0 g水蔓菁粉末置于提取烧杯中，按照液料比5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1（mL/g）加入无水乙醇，在提取温度30、40、50、60、70、80℃下，用超声波法提取，提取时间分别为20、30、40、50、60、70 min。提取液过滤，将滤液减压干燥，加入无水硫酸钠后过滤，得水蔓菁挥发油。将水蔓菁挥发油提取率作为试验指标，研究评价超声波提取法中的液料比、提取温度和超声时间对水蔓菁挥发油提取效果的影响。
通过响应面试验分析方法中的Box-Behnken试验设计，优化超声波法提取水蔓菁挥发油的最佳条件。提取优化试验的自变量为液料比（A）、提取温度（B）和超声时间（C），试验的响应值为水蔓菁挥发油提取率（Y），响应面试验设计见表1。
表1 Box-Behnken试验设计
使用Design Expert试验分析软件来分析优化响应面试验数据，水蔓菁挥发油提取率（Y）为试验指标，计算公式如下：
式中：m1为水蔓菁细粉质量，g；
m2为水蔓菁挥发油质量，g。
1.4 抗氧化试验
1.4.1 清除DPPH自由基 用无水乙醇配制成不同 浓 度 的 水 蔓 菁 挥 发 油 溶 液（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/mL），将3 mL水蔓菁挥发油溶液与3 mL DPPH试剂溶液在暗处充分混合，25℃下混合液避光反应30 min，在517 nm处测吸光值（A1），用无水乙醇代替DPPH试剂溶液，测吸光值（A2），用无水乙醇代替水蔓菁挥发油溶液，测吸光值（A0），抗坏血酸为阳性对照（敢小双等，2018）。DPPH自由基清除率的计算公式如下：
1.4.2 清除羟基自由基 取不同浓度的水蔓菁挥发油溶液2 mL，加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亚铁溶液，2 mL 6 mmol/L的过氧化氢溶液，混匀后室温静置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，混匀后于50℃保温30 min，在510 nm波长下测定其吸光度值（A1），用无水乙醇代替水杨酸，测吸光值（A2），用无水乙醇代替水蔓菁挥发油溶液，测吸光值（A0），抗坏血酸为阳性对照（李晓娟等，2021）。羟基自由基清除率的计算公式如下：
1.4.3 还原力测定 取不同浓度的水蔓菁挥发油溶液2 mL，加入2 mL pH为6.6的磷酸盐缓冲液和2 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀后50℃保温20 min，再加入2 mL质量分数为10%的三氯乙酸，混匀后3000 r/min离心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL蒸馏水和1 mL 0.1%的三氯化铁，反应10 min后在700 nm波长处测吸光值，抗坏血酸为阳性对照（罗敏等，2018）。
2.1 挥发油提取单因素试验
2.1.1 液料比对水蔓菁挥发油提取率的影响 由图1可知，增加溶液的液料比，水蔓菁挥发油提取率不断增加。液料比大于15:1（mL/g）后，提取率增加辐度较小，原因可能是溶液总量较多，挥发油的浓度相对下降，导致超声波提取的效率降低，不能完全提取水蔓菁中的挥发油成分，因此确定提取液的液料比为15:1（mL/g）。
图1 液料比对水蔓菁挥发油提取率的影响
2.1.2 提取温度对水蔓菁挥发油提取率的影响由图2可知，随着提取温度的升高，水蔓菁挥发油提取率持续增加，当溶液的提取温度超过50℃以后，挥发油提取率增加不显著，而且随着溶液温度的提高，增加了水蔓菁挥发油和乙醇的挥发量，也可能增加溶液中杂质的溶出，因而确定提取温度为50℃。
图2 提取温度对水蔓菁挥发油提取率的影响
2.1.3 超声时间对水蔓菁挥发油提取率的影响由图3可知，当溶液的超声时间为30 min时，水蔓菁挥发油提取率达最高值，继续增加超声时间，挥发油提取率将缓慢降低，可能是在超声提取过程中，由于超声时间增加，溶液的杂质溶出较多，从而影响挥发油的提取，因此确定超声时间为30 min。
图3 超声时间对水蔓菁挥发油提取率的影响
2.2 响应面试验 根据挥发油提取的单因素试验结果，进行响应面的Box-Behnken设计分析优化试验。分析优化试验的结果见表2，优化试验的方差分析结果见表3。
表2 Box-Behnke试验结果
表3 Box-Behnke试验方差分析
使用试验分析软件分析优化响应面试验数据，获得回归模型方程：
回归方程R2为0.9803，回归模型P值<0.0 001为极显著可靠，失拟项P值>0.05为不显著，CV%为1.81，信噪比为20.171，均表明试验模型的预测值与优化试验值高度相关，所得回归模型可用来分析优化水蔓菁挥发油的超声波提取条件。由表2结果可知，在影响挥发油提取率的提取条件中，影响效果是提取温度＞液料比＞超声时间。
对响应面试验分析方法所得回归模型进行数据诊断，得模型数据诊断图（图4）。残差正态概率见图4A，试验所得残差没有偏离方差，符合正态分布规律。残差与预测值对应关系见图4B，试验残差与模型预测值呈现无规律且较分散情况。残差与运行数据对应关系见图4C，试验残差与运行数据也呈现无规律且较分散情况，所有试验数据的残差范围均在±3之内。预测值与试验值对应关系见图4D，模型预测值与实际试验值对应关系良好，所得数据均接近直线分布。模型数据诊断图充分表明回归模型可靠性高，拟合程度好，可用来对水蔓菁挥发油的超声波提取条件进行分析优化（张守花等，2021）。
图4 模型数据诊断图
根据回归模型的数据分析，得到自变量交互作用的响应面试验优化分析图（图5），反映了不同因素交互作用对挥发油提取率的影响。
图5 响应面试验优化分析图
通过试验分析软件，得水蔓菁挥发油提取工艺的最优条件为液料比16.62:1（mL/g）、提取温度52.63℃、超声时间29.69 min。响应面试验预测的挥发油提取率为1.14%。结合实际的超声波提取工艺操作，将挥发油提取的最佳条件优化为液料比16.6:1（mL/g）、提取温度53℃、超声时间30 min。在此试验条件下，进行3次挥发油提取平行试验，挥发油平均提取率为1.13%。
2.3 抗氧化试验
2.3.1 水蔓菁挥发油溶液对DPPH自由基的清除率试验 由图6可知，随着挥发油浓度的增加，对DPPH自由基的清除率逐渐增强。当挥发油浓度为8 mg/mL时，清除率较高且稳定，当挥发油浓度为12 mg/mL时，清除率达到88.5%。但清除作用略小于抗坏血酸（Vc）。结果表明，水蔓菁挥发油在一定浓度下，对DPPH自由基有较强的清除能力。
图6 清除DPPH自由基
2.3.2 水蔓菁挥发油溶液对羟基自由基的清除率试验 由图7可知，羟基自由基的清除率随着挥发油浓度的增加而逐渐增强，当挥发油浓度为12 mg/mL时，清除率达到82.7%。结果表明，挥发油达到一定浓度时，对羟基自由基有较强的清除能力。与同浓度Vc相比较，挥发油对羟基自由基的清除率比Vc要略低。
2.3.3 水蔓菁挥发油还原力测定试验 由图8可知，水蔓菁挥发油具有较好的还原力，随着挥发油浓度的持续增加，还原力也不断增强。与同浓度Vc相比较，挥发油的还原力比Vc要略低，但挥发油在较高浓度时，也表现出良好的还原力。
图8 还原力测定
本试验通过超声波法对水蔓菁中的挥发油成分进行了提取分离，运用响应面试验分析优化方法对挥发油提取条件进行了优化。得到最优的挥发油提取参数为液料比16.6:1（mL/g）、提取温度53℃、超声时间30 min，在此提取条件下，水蔓菁挥发油提取率为1.13%。抗氧化试验结果表明，抗氧化活性随着水蔓菁挥发油浓度的提高而增强，挥发油浓度为12 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为88.5%，对羟基自由基的清除率为82.7%，并表现出较强的还原力。超声波法提取所得水蔓菁挥发油具有良好的抗氧化能力。
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