朱俊访，李博，潘晓瑜，杨悦
(广东食品药品职业学院，广州 510520)
延胡索为罂粟科(Papaveraceae)紫堇属Corydalis Vent.植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎，其主要活性成分是生物碱类成分，具有显著的镇痛、镇静和催眠作用，对冠心病、心律失常、胃溃疡等多种疾病有较好的临床效果[1-2]。延胡索生物碱的提取纯化多采用水提醇沉、大孔树脂纯化等方法[3]，但这些方法成本高、耗时费力，难以满足工业化大生产的需要。为提高产品质量及绿色中药的发展要求，有必要对延胡索生物碱提取纯化工艺进行深入研究。膜技术是一种新型分离技术，具有高效、节能、无污染、分离效率高等优点，在传统中药提取方面已经取得了很好的研究成果，目前在中药的生产过程中应用的膜技术主要包括微滤、超滤和纳滤[4-5]。分子印迹技术是一种高选择性的分离技术，在物质分离纯化领域有着极大的发展潜力和非常重要的应用前景[6]。目前的膜分离都是以筛分机制实现对物质的分离，无法实现对特定物质的选择性分离。而分子印迹膜则将分子印迹聚合物对模板分子的专一识别特性与膜分离的可连续化操作特点相互结合，为实现特定物质的特异性分离提供了有效途径。膜技术、分子印迹技术联合应用在延胡索生物碱类物质的分离笔者尚未见报道。本文将膜分离技术与分子印迹技术相结合，加以改进，以节约能耗、降低生产成本为目的，并为膜分离技术在药物分离方面的应用提供基础数据。
实验用膜分离装置MSM2013(上海摩速科学器材有限公司)；
AUY120万分之一电子天平(日本岛津仪器公司，感量：0.1 mg)；
UV2600紫外分光光度计(尤尼科仪器有限公司)；
聚醚砜平板膜(截留分子量10 000，5000，3500，1000，中科瑞阳膜技术有限公司，批号：2020UE001)；
延胡索乙素(THP)对照品(含量≥98%，西安沃森生物科技有限公司，批号：20181226)；
葡萄糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20190706)；
甲基丙烯酸(分析纯，科密欧化学试剂有限公司，批号：20180808)；
偶氮二异丁氰(分析纯，科密欧化学试剂有限公司，批号：2019003)；
乙二醇二甲基丙烯酸酯(含量：98%，阿拉丁生化科技有限公司，批号：D1629145)。延胡索购自广州清平药材市场，经广东食品药品职业学院梁永枢副教授鉴定为正品。
2.1延胡索总生物碱与多糖的含量测定
2.1.1对照品溶液制备 精密称取延胡索乙素50 mg置于50 mL量瓶中，加入5%硫酸溶液1 mL溶解，加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH值4.0)定容至刻度，得对照液母液。精密量取对照液母液1 mL至10 mL量瓶，加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH值4.0)定容至刻度，得对照储备液。
2.1.2延胡索生物碱标准曲线的制备 分别精密量取对照储备液0，0.2，0.5，0.6，0.8，1.0，1.3，1.5 mL至5 mL量瓶，加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH值4.0)定容至刻度，得系列对照品溶液。分别精密吸取延胡索乙素对照品溶液1.0 mL置于分液漏斗中，各加柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液12.0 mL，再加0.04%溴甲酚绿溶液3.0 mL，用三氯甲烷9.0 mL振摇提取2 min，静置40 min，取三氯甲烷层置于有0.2 g无水硫酸钠的具塞试管中，在409 nm处测定吸光度(A)[7-8]。得吸光度(A)与浓度(C)的线性关系为A=0.054 6C+0.038 4，R2=0.999 0。
2.1.3多糖标准曲线 精密称取经105 ℃干燥至恒重的葡萄糖，配制0.1 mg·ml-1葡萄糖的标准溶液。精密吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL葡萄糖标准溶液至10 mL具塞试管，加纯化水至2 mL，分别加入5%苯酚1 mL，98%硫酸5 mL，摇匀静置30 min，于489 nm测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线[9]，得吸光度(A)与浓度(C)的线性关系为A=7.082C+0.013 2，R2=0.999 1。
2.2延胡索生物碱样品制备
2.2.1延胡索提取液的制备 称取经粉碎过孔径约0.25 mm(60目)筛的延胡索粉末300 g，加水10 L浸泡，浸泡3次，每次24 h，过滤，合并滤液，得延胡索提取液。
2.2.2膜分离延胡索生物碱研究[10-13]
(1)不同截留分子量超滤膜分离研究。量取延胡索提取液4份，每份5 L，室温下用孔径5 μm微孔滤膜抽滤，得延胡索微滤液。取4份延胡索微滤液，分别使用截留分子量为10 000，5000，3500，1000的聚醚砜平板膜进行错流循环超滤(图1)，膜有效面积为70 cm2，得4份延胡索超滤液。按“2.1.2”项方法测定微滤液、4份超滤液中生物碱含量，并计算各滤液的固形物含量、生物碱转移率和除杂率，结果见表1。结果显示，随着超滤膜截留分子量的减小，料液中固形物含量、生物碱总量和转移率都依次降低，但随着除杂率不断提高，生物碱含量先增大后减小。其中分子量为10 000超滤液中的生物碱总量最高，但由于除杂率较低导致其生物碱含量不及分子量为5000超滤液。综合考虑生物碱转移率、除杂率以及生物碱含量，初步选定截留分子量为5000的超滤膜分离效果较好。
表1 延胡索提取液、微滤液和超滤液结果 Tab.1 Results of yanhusuo extract，microfiltration and ultrafiltration
图1 错流循环超滤装置 Fig.1 Cross flow circulating ultrafiltration device
(2)超滤膜动态分离研究。量取延胡索提取液5 L，室温下先用孔径5 μm微孔滤膜抽滤，再使用截留分子量为5000的聚醚砜平板膜进行错流循环超滤，每超滤600 mL收集一份超滤液，共收集6份，按“2.1.2”项和“2.1.3”项方法分别测定超滤液中THP和多糖含量，结果见图2。结果显示，THP能较好地穿过超滤膜，而大部分的多糖则被截留，说明该超滤膜能稳定有效地截留大分子物质。
图2 不同时间超滤液中THP和多糖含量 Fig.2 Contents of THP and polysaccharide in ultrafiltration at different times
(3)料液超滤温度研究。采用截留分子量为5000的超滤膜，操作压力设为0.35 MPa，过膜速率为400 mL·min-1，测定不同温度下膜通量的变化，结果见图3。由图中曲线可以看出，当温度在<30 ℃，膜通量随温度的升高而明显升高，这可能与溶液温度的升高降低了溶液粘度并且提高了超滤膜两侧的溶质的扩散速度有关。温度>30 ℃，膜通量随温度的升高增加缓慢。综合考虑温度对膜通量影响和实际操作性，初步选定料液超滤温度为30 ℃。
图3 料液温度对膜通量的影响 Fig.3 Effect of feed liquid temperature on membrane flux
(4)超滤操作压力研究。采用截留分子量为5000的超滤膜，溶液温度设定为30 ℃，过膜速率为400 mL·min-1，测定不同操作压力下膜通量的变化，结果见图4。由图中曲线可以看出，膜通量随着操作压力的增大迅速增大，压力是超滤膜的传质推动力，料液中的溶剂和小分子物质在压力推动作用下通过膜，压力越大推动力越强通量越大。当操作压力达到0.3MPa后膜通量增加缓慢变化趋于稳定，这可能与操作压力增大促进超滤膜表面形成凝胶层有关，膜表面的凝胶层增大了料液的透过阻力。结合试验结果与实际操作条件，初步选定最佳操作压力为0.35 MPa。
图4 操作压力对膜通量的影响 Fig.4 Effect of operating pressure on membrane flux
(5)超滤过膜速率研究。采用截留分子量为5000的超滤膜，溶液温度设定为30 ℃，操作压力设为0.35 MPa，测定不同过膜速率下膜通量的变化，结果见图5。由图中曲线可以看出，膜通量随着过膜速率的增大迅速增大，增大流速可以起到边渗透边洗膜的作用，当过膜速率达到400 mL·min-1后膜通量增加缓慢变化趋于稳定，这可能与流速加快增加了组件压力损失有关。结合实验结果与实际操作条件，初步选定最佳过膜速率为400 mL·min-1。
图5 过膜速率对膜通量的影响 Fig.5 Effect of membrane passing rate on membrane flux
(6)超滤工艺优化。根据实验结果，以温度、压力和过膜速率为影响因素，应用中心组合实验方法进行三因素三水平的实验设计[14-15]，以延胡索生物碱透过率和高分子截留率为响应值，采用综合评分(Y)评价超滤工艺，延胡索中含有大量的多糖类物质，因此延胡索生物碱透过率与多糖截留率均为评价指标，并予以相同的权重，由此制定的评分标准为Y=生物碱透过率×0.5+多糖截留率×0.5。星点设计的因素水平见表2。响应面实验设计方案及实验结果见表3。
表2 设计因素及水平 Tab.2 Table of design factors and levels
表3 响应面实验设计方案及试验结果 Tab.3 Response surface experimental design scheme and results
利用统计分析软件Design-expert对所得数据进行分析，回归分析结果见表4。当Prob>F值小于0.05即表示该项指标对模型影响显著，从回归分析结果看，整体模型的Prob>F值=0.001 5，表明该二次方程显著。操作压力(Prob>F=0.001 1)和料液温度(Prob>F=0.017 3)与Y的线性关系显著。从Prob>F值可推断出各因素对多糖得率的影响顺序为：压力>温度>过膜速率。失拟项的Prob>F值为0.615 2，不显著，该模型拟合程度较好，从而说明该模型能够对超滤膜分离延胡索生物碱进行准确的预测和分析。进行多元回归拟合，得Y对A、B和C的二次多元回归方程。Y=66.56-0.72A+1.24B+0.33C+0.94AB-0.29AC+0.022BC-1.74A2-1.44B2-0.97C2，相关系数R2=0.942 4。
表4 回归分析结果 Tab.4 Regression analysis results
图6分别为3个影响因素两两之间相互作用的响应面曲线，图中显示了温度、压力和流速之间存在交互作用，随着其中两个因素的增大，综合评分先增大后减小，影响因素B>A>C，3个因素中超滤压力对综合评分的大小影响最显著。经计算确定截留分子量为5000的超滤膜分离延胡索生物碱的最佳工艺为料液温度29.5 ℃，操作压力为0.37 MPa，过膜流速为419 mL·min-1，预测综合评分Y结果为66.87。
图6 各因素的相互影响 Fig.6 Interaction of various factors
(7)膜分离验证试验。按上述工艺进行重复性试验3次，所得超滤液按“2.1.2”项和“2.1.3”项方法测定延胡索生物碱和多糖含量，计算延胡索生物碱透过率、多糖截留率和综合评分Y，结果见表5。延胡索生物碱平均透过率为60.8%，多糖截留率为72.7%，综合评分Y为66.78与预测结果接近，说明该实验所得到的数学模型可靠，其工艺参数准确可信，具有良好的预测性。
表5 验证实验结果 Tab.5 Results of validated experimental%
2.3分子印迹膜分离延胡索生物碱研究
2.3.1分子印迹膜制备 按文献[16]所述过程，采用紫外光引发聚合，制备延胡索乙素分子印迹复合膜，步骤如下：取模板分子THP 溶解在三氯甲烷中，加入5倍量功能单体MAA，超声混匀，加入20倍量的交联剂EDMA，最后加入AIBN，超声溶解，得预聚液，将PVDF膜浸泡于预聚液中20 min，取出通过紫外光引发聚合，制备THP分子印迹复合膜。非印迹复合膜的制备除不加模板分子THP外，其余操作同印迹复合膜的制备[16]。
2.3.2THP印迹复合膜分离延胡索生物碱 自制2个一侧带圆孔的玻璃池，将THP印迹复合膜(直径1.5 cm)固定于两玻璃池的圆孔之间，一个为渗透池，另一个为透过池，组成渗透装置。渗透池中放入截留分子量为5000的超滤液100 mL，透过池中放入2%醋酸溶液100 mL，磁力搅拌器搅拌24 h，分别在6，12和24 h取样，按“2.1.2”项方法测定生物碱含量和24 h后透过液固形物中生物碱含量，考察THP印迹复合膜对超滤液中生物碱成分的透过性能，重复3次，结果见表6。结果显示在渗透6，12和24 h后 PVDF膜的透过液生物碱透过率最高，非印迹复合膜的透过液生物碱透过率最低，THP印迹复合膜膜透过液固形物中生物碱含量最高，达到7.5%。
表6 PVDF膜、THP印迹复合膜和非印迹复合膜不同时间透过结果 Tab.6 Transmission results of PVDF membrane，THP imprinted membrane and non imprinted membrane at different times
延胡索主要成分为生物碱，此外还含有大量的淀粉、树脂和多糖等大分子物质，其中延胡索总生物碱在水中略溶，溶解度大约10 mg·mL-1[17]，基于操作便捷与经济环保考虑本文采用水浸泡提取。超滤中膜的截留分子量越小，除杂率越高，但有效成分损失也越大，并且渗滤速度和膜通量下降明显。提高压力能增加膜通量，但也会促进膜表面形成凝胶层增加渗透阻力。升高温度能促进膜表面溶质向主体运动，提高过滤速度，但也会相应加速超滤膜老化。增大流速能减小膜表面凝胶层的厚度，但也会增加膜表面的磨损。本研究采用截留分子量为5000的超滤膜可获得较好的生物碱转移率和较高的膜通量，并能有效除去延胡索提取液中的大分子物质。延胡索提取液使用孔径5 μm微滤膜抽滤，然后在溶液温度为29.5 ℃，操作压力为0.37 MPa，过膜流速为419 mg·min-1，使用截留分子量为5000的超滤膜对延胡索提取液进行错流循环超滤，所得超滤液中生物碱含量最高。钟莲等[18]研究了石硫法、水提醇沉法、D101大孔树脂和732型阳离子树脂对延胡索乙素的纯化工艺，延胡索乙素含量分别为0.41%，0.30%，1.08%和1.19%，与本文结果比较显示，超滤法具有一定优势。超滤法与传统方法比较，不仅操作简单、省时高效、节能，且无二次污染，如果清洗使用得当超滤膜可长期循环使用，具有较高的经济性。膜分离在中药化学成分分离中应用，需面临膜污染与膜吸附的问题，一般可通过膜改性来解决此方面问题，这也是笔者进一步研究的方向。
THP印迹复合膜和非印迹复合膜在聚合过程中在PVDF膜表面形成了聚合物，膜的孔径变小，而THP印迹复合膜表面存在延胡索乙素三维结构空穴，3种膜的孔径大小为PVDF膜>THP印迹复合膜>非印迹复合膜，因此印迹膜分离延胡索生物碱试验中PVDF膜的生物碱透过率最高，非印迹复合膜的生物碱透过率最低。经过24 h膜渗透，由于延胡索中生物碱成分的结构与模板分子THP的结构相似，相对其他成分更容易通过印迹膜的空穴结构，而PVDF膜和非印迹复合膜不存在印迹空穴，料液中各种成分的透过率差异小，因此THP印迹复合膜的透过液固形物中生物碱含量最大。
本文首先对延胡索提取液进行超滤，所得超滤液中生物碱含量比原提取液中生物碱含量提高了23%，超滤液利用分子印迹膜进一步纯化，最终生物碱含量提高了3倍。综上，膜分离技术能有效去除延胡索水提液中的大分子杂质，明显提高生物碱含量，且分子印迹膜分离实验显示其在分离延胡索生物碱的可行性，本研究为膜技术和分子印迹技术联用分离中药有效物质奠定了一定的基础。
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