于劲松， 周栩丹， 王晗玥， 叶 泰， 吴秀秀， 曹 慧，袁 敏， 徐 斐， 肖诚傲， 杨 琦
上海理工大学 健康科学与工程学院，上海 200093
重金属镉是人体的非必需元素，它的特性是有毒、致癌和致突变，在国际癌症研究机构的致癌物清单中，它属于I类致癌物[1, 2]。此外，镉元素还具有蓄积特性，半衰期可达数十年以上，一旦被人体吸收则很难清除[3]。镉进入人体的途径包括消化道、呼吸道等[4]。空气中含有的镉可通过呼吸道被人体吸收，食物中污染的镉可通过消化道进入人体产生蓄积[5, 6]。目前，有关重金属镉的检测方法最常见的有：原子吸收分光光度法(AAS)，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)[7-9]。这两种方法所需要的设备比较昂贵，适用于实验室进行相关的检测研究。但在实际的生产生活中，还需要开发一些快速简便的方法，而进行检测方法的开发，需要对镉导致对人体产生危害的机理进行研究[10, 11]。目前，已有相关的镉导致人体中毒的机理研究，但是采用热力学方法的研究内容还较少。众所周知，人体的组成离不开蛋白质，而氨基酸又是构成人体所需蛋白质的基本物质。因此，研究氨基酸和重金属镉的结合机理，对于了解镉对人体的危害具有重要的意义[12, 13]。
等温滴定量热法是研究物质结合的金标准[14-16]，本文采用该方法研究了重金属镉与人体必需的20种氨基酸的结合过程，并探讨了环境条件(缓冲液pH、缓冲液离子强度、温度)变化对镉与氨基酸亲合过程的影响。本文的研究内容从热力学的角度解释了镉与氨基酸类功能单体的亲合机制，是镉与氨基酸结合研究的重要理论补充，也可为镉导致人体中毒机理的研究提供一定的参考，为后续镉离子检测方法的开发打下了基础。
1.1 材料与设备
氨基酸：苯丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸脯氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、颉氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，氢氧化钠，均购自国药基团化学试剂有限公司；
等温滴定量热仪(VPITC)(美国马尔文仪器有限公司)，pH计(S210-K，梅特勒托利多)。
1.2 氨基酸类单体与镉相互作用的等温滴定量热试验设计
在VPITC型等温滴定量热仪上进行等温滴定试验，首先为确保仪器的稳定性和未被污染，先进行水滴水试验，水滴水试验正常后正式进行试验。第一步，先将300 μL浓度为10 mmol/L的氯化镉溶液装入到VPITC的注射器中，然后再使用进样针向反应池中注入1 448 μL一定浓度的单体溶液，试验中设置反应温度至25 ℃，控制搅拌速度控制为372 r/min，滴定间隔控制为150 s，共滴定20次。试验在VPITC基线稳定后开始正式滴定，滴定试验结束后，使用VPITC自带的软件对结果进行拟合分析。为扣除试验背景结果带来的影响，每次试验后进行氯化镉滴定缓冲液试验，每个结果均扣除背景。
2.1 氨基酸类功能单体与镉相互作用的亲合方式和驱动力
进行了一个系统的等温滴定量热法(ITC)研究，分析了重金属镉离子滴加到20种基本氨基酸的等温滴定量热曲线，实验结果如图1所示。
图1 镉离子滴定20种氨基酸的等温滴定量热曲线(298 K)
将图1中上半部分的热量进行积分得到下半部分的点图，之后再运用合适的模型对各点进行拟合，得到亲合力(K), 化学计量比(N) 和反应焓变(ΔH)，结果如表1所示。从K值来看，半胱氨酸与镉亲和的K值最大，达到了106水平，表明氨基酸中半胱氨酸与镉的亲和力最强；
其次是结构中含有咪唑基团的组氨酸，K值达到了103，之后是天冬氨酸和苏氨酸。与上述几个氨基酸相比，其他几个氨基酸与镉亲合的K值、焓变(ΔH)都不高。REMELLI M等人[17]研究了Cd(II)与其他二价过渡金属离子在与氨基酸、多肽和螯合剂形成络合物过程中的竞争关系，其研究结果显示：通过比较积累稳定常数(log β110)，各氨基酸与镉结合物的稳定性排序为cys(12.82)>his(5.74)>asp(4.35)>gly(4.24)，这与本文得到的各氨基酸与镉的亲和力结果排序是一致的。
表1 镉与氨基酸类功能单体结合的热力学参数分析
结合表1中焓变(ΔH)和熵变(ΔS)数据，根据表2中的公式(ΔG=ΔH-TΔS)，可以得到每种氨基酸与镉结合的驱动力类型[18]：除半胱氨酸存在焓熵双驱动外，其他氨基酸与镉结合的驱动力都是熵驱动。参考相关文献，还可以获知各个氨基酸与镉的亲合作用方式：除半胱氨酸与镉存在配位作用外，其他氨基酸与镉的结合均为静电相互作用(注：脯氨酸与镉不存在相互作用)。
表2 化学反应驱动力及自发性的判断
为了验证氨基酸与镉结合的具体基团，研究了二硫苏糖醇(DTT)、二水合柠檬酸三钠(Sodium citrate)和三羟甲基氨基甲烷(Tris)与镉的结合ITC试验，结果如图2所示。
图2 DTT(左)、二水合柠檬酸三钠(中)和Tris(右)与镉的结合ITC试验研究
从图2中结果发现，二硫苏糖醇与镉的结合为放热且放热信号明显大于Cys，可以确认巯基与镉的结合为放热；
含有相当于三个羧基的二水合柠檬酸三钠，相比图1中的甘氨酸和天冬氨酸，显示的结合信号也是吸热，但是信号更强，表明羧基与镉的结合为吸热，且吸热强度与羧基的数量成正比。对于结构中没有羧基，只有氨基和羟基的Tris来说，它与镉的结合信号微弱。由表3可见，结构中含有两个巯基的二硫苏糖醇与镉亲合的作用方式为配位键，驱动力为焓熵双驱动，氨基酸中只有半胱氨酸(结构中含有一个巯基)的作用方式和驱动力与之相同，有次可以推测半胱氨酸与镉的亲合主要是通过巯基与镉离子之间形成配位键实现的。Elena Chekmeneva等人[19]研究了结构中也含有巯基的谷胱甘肽(GSH)与镉离子的亲合过程：在pH 7.4的Tris缓冲液中，采用5 mmol/L的镉滴定0.2 mmol/L的GSH，其滴定图谱同样显示为一个放热过程，其放热焓变(ΔH)为-20.8 kcal/mol。本研究中的亲合反应是在HEPES中进行的，采用2 mmol/L的镉液滴定0.05 mmol/L半胱氨酸溶液，其放热焓变(ΔH)为-2.38 kcal/mol(表1)；
采用2 mmol/L的镉液滴定0.05 mmol/L二硫苏糖醇溶液，其放热焓变(ΔH)为-4.18 kcal/mol(表3)，虽然反应环境不同，但含巯基单体与镉的热力学行为和参数是一致的。
表3 镉与氨基酸类功能单体结合的热力学参数分析
2.2 pH、离子强度、温度等条件对镉与半胱氨酸亲合的作用方式和驱动力影响
在前面研究的基础上，以半胱氨酸为对象，研究了pH、离子强度、温度等环境条件变化对镉与半胱氨酸相互作用的亲合方式和驱动力影响。首先，采用ITC方法，考察了在25 ℃温度下，不同pH条件下，镉与半胱氨酸结合的差异，结果见图3和图4。
图3 不同pH下(Mes缓冲液)Cd(II)与半胱氨酸结合的ITC试验
图4 不同pH下(HEPES缓冲液)Cd(II)与半胱氨酸结合的ITC试验
从图3可以看出，随着pH的降低，Cd(II)与半胱氨酸结合的放热量在逐渐降低，MES缓冲液的有效pH范围是5.5～6.7，降低pH不利于二者的结合。进一步采用HEPES缓冲体系考察了在pH 6.8～8.2范围内Cd(II)与半胱氨酸结合的情况，结果如图4和表4所示。
表4 不同pH下Cd(II)与半胱氨酸结合的ITC试验数据(25 ℃)
需要说明的是，在pH8.2条件下，Cd(II)是无法长时间稳定存在的，在若干分钟内即会出现絮状悬浮物，这应该是由于在该碱性pH条件下的Cd(II)与环境中的OH-结合生成Cd(OH)2不溶物造成的。在中性和酸性条件下则没有出现此现象。由表4可见pH低于7.5时，镉与半胱氨酸结合的作用方式为配位键，驱动力为焓熵双驱动；
pH大于等于7.5时，作用方式为两种，增加了静电相互作用，驱动力也是焓熵双驱动和熵驱动两种方式。可见，pH的变化对于镉与半胱氨酸的亲合过程影响还是非常明显的。
在上述pH条件研究的基础上，选择pH 6.0，研究了缓冲液离子强度对Cd(II) 与半胱氨酸亲合过程的影响，结果如图5所示。
图5 离子强度变化对Cd(II)与半胱氨酸结合的ITC试验
由图5和表5可见，在相同pH(6.0)、相同反应温度(25 ℃)的情况下，改变离子强度，半胱氨酸与Cd(II)的相互作用强度没有明显的差异。随着离子强度的升高，相互作用的焓变略微增加，但二者亲合的作用方式和驱动力并未发生变化。总体来说，该范围内离子强度的变化对二者的结合影响很小。
表5 不同离子强度下Cd(II)与半胱氨酸结合的ITC试验数据(25 ℃)
在前述研究的的基础上，采用离子强度为25 mmol/L pH 6.0的Mes缓冲体系，考察了不同温度下(25 ℃、35 ℃和45 ℃)镉与半胱氨酸结合的差异，结果见图6。
图6 不同温度下(25 ℃、35 ℃和45 ℃)Cd(II)与半胱氨酸结合的ITC试验
从图6和表6中可见，随着温度逐渐升高，二者的结合产生的热量值(ΔH)有逐渐变小的趋势，亲合力K值也是逐渐降低。推测升高温度，不利于二者的结合。此外，温度变化(25 ℃～40 ℃)并未改变镉离子与半胱氨酸亲合时的作用方式和驱动力，仍为配位键结合和焓熵双驱动方式。
表6 不同温度下Cd(II)与半胱氨酸结合的ITC试验数据(pH=6.0)
本文采用等温滴定量热法，研究了重金属镉与氨基酸类单体相互作用的亲合方式、驱动力，并探讨了环境条件变化对二者亲合的影响。结果显示：除脯氨酸外，其它氨基酸与镉离子都可以相互亲合。
各氨基酸在与镉的结合过程中，巯基为放热结合位点，结合能力最强；
羧基为吸热结合位点，结合能力次之；
氨基为微弱的吸热位点，结合能力最差，基本无结合。组氨酸中的咪唑基团与镉的结合作用，要明显大于羧基；
咪唑基团与镉离子的结合是一个吸热结合。半胱氨酸与镉离子的亲合能力最强，二者的作用方式为配位键和静电相互作用，驱动力为焓熵双驱动和熵驱动两种；
其他氨基酸与镉的作用方式均为静电相互作用，驱动力为熵驱动，所有的亲合过程均是可以自发进行的。
在pH 5.5～8.2范围内，低pH 5.5和高pH 8.2不利于Cd(II)与半胱氨酸的结合，酸性环境有利于Cd(II)的稳定存在，偏碱的条件Cd(II)易与环境中的OH-结合生成Cd(OH)2不溶物。pH 6.0～7.5范围利于Cd(II)与半胱氨酸的结合。升高温度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)，并不有利于Cd(II)与半胱氨酸的放热结合。离子强度的变化(25 mmol/L～100 mmol/L)对Cd(II)与半胱氨酸的结合影响很小。
本文从热力学的角度解释了镉与氨基酸类功能单体的亲合机制，明确了氨基酸和镉亲合的亲合方式和驱动力，是镉与氨基酸结合过程研究的重要理论补充，也为重金属导致人体中毒机理的机理研究提供一定的参考。此外，氨基酸类功能单体与镉亲合过程的探索，有助于有关重金属镉的检测过程中的识别元件的制备研究，为后续镉离子检测方法的开发提供重要的试验和理论指导。
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