黎志豪，黄宝华,*，甄维聪，周金林，卢宇靖
（1.广东工业大学轻工化工学院，广东 广州 510006；
2.广东金骏康生物技术有限公司，广东 佛山 528225；
3.梅州金柚康健康科技有限公司，广东 梅州 514021；
4.广东工业大学生物医药学院，广东 广州 510006）
二氢查耳酮是黄酮类化合物中的一类，含有如图1所示的基本骨架。天然二氢查耳酮主要以糖苷形式存在于蔷薇科、壳斗科植物中，如多穗柯叶中的三叶苷、根皮苷和3-羟基根皮苷[1]。研究表明，大多数二氢查耳酮糖苷没有毒性，水溶性和稳定性比非糖苷类的二氢查耳酮高[2-3]。糖基类型、数目和连接位点的不同使二氢查耳酮类化合物的结构具有多样性，从而具有广泛的生物活性。据报道，三叶苷可以通过调节线粒体活性氧的内稳态减少双氧水对大鼠嗜铬细胞瘤细胞诱导的氧化损伤[4]；
根皮苷对糖尿病具有治疗和预防作用[5-6]。已发现一些二氢查耳酮具有高甜、低热量的特性，如新橙皮苷二氢查耳酮（neohesperidin dihydrochalcone，NHDC）甜度约是蔗糖的1 000 倍，柚皮苷二氢查耳酮（naringin dihydrochalcone，NarDC）是蔗糖的300 倍[7]。NHDC是很好的苦味抑制剂[8]，NHDC、橙皮素二氢查耳酮-7-葡萄糖苷（hesperetin dihydrochalcone-7-O-glucoside，HDC-7-G）和新地奥明的三元复配物能有效降低柑橘果酒的苦味[9]。但并非所有二氢查耳酮都具有甜味，如根皮素仅有微弱的甜味[10]，而橙皮素二氢查耳酮具有较强的甜味[11]，二者结构相似，差异在B环上，前者连有4’-OH，后者连有3’-OH和4’-OCH3。Winnig等[12]运用突变分析结合功能研究，通过分子建模，确认人类甜味受体上具有NHDC的结合位点。有研究提及二氢查耳酮甜味强度似乎与A环上的羟基个数有关[13]；
当B环上两个相邻取代基之间有氢键形成时，则会导致与受体的结合程度减弱而使甜味降低[11]。本实验利用廉价易得的柚皮苷为前体，合成一系列B环上有不同取代基的二氢查耳酮衍生物，以期筛选出安全无毒、高甜和具有良好生物活性的化合物。基于感官评价和电子舌检测结果探究二氢查耳酮衍生物的结构与甜味的相关性，为开发安全高效的甜味剂、矫味剂提供科学参考。
图1 二氢查耳酮的骨架结构Fig. 1 Backbone structure of dihydrochalcone
电子舌是近年发展起来的一种智能味觉分析技术，其客观性和可比性优于感官评价法。目前已广泛应用于食品的味道评价[14]。日本Insent公司开发的甜味传感器是基于表面的人工双层脂质膜和呈味物质之间产生氢键作用[15-16]、静电作用和疏水作用[17-18]引起膜电位的变化被分析器捕获，对食品和饮料的甜味强度进行量化[19]。本课题组前期工作证实，该甜味传感器对二氢查耳酮化合物甜味评价具有一定的可靠性[20]。本实验利用感官评价和电子舌检测相结合对相关化合物甜味进行评价和比较。
1.1 材料与试剂
人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK2） 武汉普诺赛生命科技有限公司。
苯甲醛 广州化学试剂厂；
对甲氧基苯甲醛北京伊诺凯科技有限公司；
4-氯苯甲醛 阿达玛试剂有限公司；
吡咯烷、3,5-二甲基-4-羟基苯甲醛、3,4,5-三甲氧基苯甲醛、2-羟基苯甲醛 上海麦克林生化科技有限公司；
香草醛、3-羟基苯甲醛、3-氟苯甲醛、3-氯苯甲醛、对甲基苯甲醛、对氟苯甲醛、3,4-二甲氧基苯甲醛、噻唑蓝 阿拉丁试剂有限公司；
蔗糖 天津市大茂化学试剂厂；
以上及其余常规试剂均为分析纯；
柚皮苷、NarDC、NHDC、三叶苷、HDC-7-G、根皮苷（纯度均不小于98%） 广东金骏康生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
AVANCE III HD 400型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）仪 瑞士Bruker公司；
SA-402B味觉分析系统 日本Insent公司；
Multiskan FC型酶标仪、Forma 3111二氧化碳培养箱 美国赛默飞公司；
SGW®X-4A显微熔点仪 上海仪电物理光学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 二氢查耳酮衍生物的合成及表征
1.3.1.1 合成
合成方法如图2所示。
参照文献[21]合成化合物根皮乙酰苯-4’-β-新橙皮苷。称取一定量柚皮苷加入12% NaOH溶液，100 ℃搅拌回流2 h。经冷却，加入盐酸溶液中和，析出黄色固体后经抽滤、去离子水洗涤、75%乙醇溶液重结晶、抽滤和减压干燥等步骤得到淡黄色粉末根皮乙酰苯-4’-β-新橙皮苷。
参照文献[22]合成化合物3a～3m。以3a为例，称取根皮乙酰苯-4’-β-新橙皮苷溶于一定量的无水乙醇，依次加入苯甲醛、乙酸和吡咯烷，氮气保护下80 ℃搅拌24 h，过滤收集析出的固体，经去离子水洗涤、真空干燥得到白色粉末固体（3a）。其余化合物的合成不需要氮气保护。3c～3f、3h～3m不能析出固体，需利用硅胶柱层析分离，选用V（二氯甲烷）∶V（甲醇）=8∶2的混合溶剂作为洗脱剂。
参照文献[23]合成化合物4a～4m。以4a为例，称取一定量3a于50 mL圆底烧瓶中，加入5% NaOH溶液，超声辅助溶解后加入钯碳催化剂，通入氢气，30 ℃反应24 h。其后缓慢加入稀盐酸中和、抽滤析出的固体得到4a。4c、4e、4f、4i不能直接析出固体，需经乙酸乙酯萃取、洗涤、干燥、旋蒸可获得产物。
1.3.1.2 表征
4a（白色固体）：熔点144.7～148.2 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.30（s, 2H）、7.32～7.23（m, 4H）、7.18（tq,J＝6.1, 2.3, 1.9 Hz, 1H）、6.01（s, 2H）、5.35～5.25（m, 1H）、5.14～5.02（m, 3H）、4.66（dd,J＝9.2, 4.5 Hz, 2H）、4.56（d,J＝5.7 Hz, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.68（dt,J＝5.7, 3.5 Hz, 2H）、3.45～3.43（m, 1H）、3.32（d,J＝5.9 Hz, 7H）、3.22～3.15（m, 2H）、2.90（t,J＝7.6 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.26、164.22、163.39、141.99、128.80、126.31、105.75、101.09、97.57、95.27、77.62、77.30、77.08、72.31、70.98、70.87、69.91、68.80、60.75、45.70、30.49、18.60。
图2 二氢查耳酮衍生物的合成Fig. 2 Synthesis of the dihydrochalcone derivatives
4b（白色固体）：熔点157.8～161.5 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.31（s, 2H）、7.96（s, 1H）、6.77（s, 2H）、6.01（s, 2H）、5.33～5.27（m, 1H）、5.14～5.02（m, 3H）、4.66（dd,J＝8.4, 4.5 Hz, 2H）、4.56（t,J＝5.6 Hz, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.68（ddd,J＝12.8, 7.9, 5.6 Hz, 4H）、3.55～3.48（m, 1H）、3.45（dt,J＝6.3, 2.9 Hz, 2H）、3.30（d,J＝3.5 Hz, 1H）、3.27～3.23（m, 1H）、3.23～3.12（m, 2H）、2.72（dd,J＝8.7, 6.8 Hz, 2H）、2.12（s, 6H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.61、164.22、163.34、151.66、132.16、128.49、124.48、105.74、101.09、97.57、95.25、77.62、77.29、77.08、72.31、70.97、70.86、69.91、68.80、60.75、46.32、29.88、18.59、17.10。
4c（黄色固体）：熔点145.9～151.5 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.34（s, 2H）、7.16～7.05（m, 4H）、6.01（s, 2H）、5.32（d,J＝4.4 Hz, 1H）、5.19～5.02（m, 3H）、4.66（d,J＝4.3 Hz, 1H）、4.53（d,J＝35.3 Hz, 2H）、3.68（ddd,J＝11.9, 7.4, 2.7 Hz, 3H）、3.53～3.47（m, 2H）、3.46～3.43（m, 1H）、3.27（s, 4H）、3.21（q,J＝9.3, 8.0 Hz, 2H）、2.85（t,J＝7.6 Hz, 2H）、2.26（s, 3H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.33、164.22、138.85、135.18、129.36、129.32、128.67、105.76、101.08、97.58、95.25、77.63、77.30、77.06、72.32、70.98、70.86、69.92、68.80、60.75、45.83、30.11、21.09、18.60。
4d（黄色固体）：熔点141.3～146.3 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.30（s, 2H）、7.19～7.12（m, 2H）、6.88～6.80（m, 2H）、6.01（s, 2H）、5.33～5.27（m, 1H）、5.14～5.01（m, 3H）、4.66（dd,J＝9.1, 4.5 Hz, 2H）、4.62～4.52（m, 1H）、4.47（d,J＝5.9 Hz, 1H）、3.71（s, 3H）、3.70～3.63（m, 3H）、3.51（dd,J＝11.8, 6.3 Hz, 1H）、3.45（dt,J＝6.3, 2.9 Hz, 3H）、3.31～3.22（m, 2H）、3.21～3.13（m, 2H）、2.83（t,J＝7.6 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.42、164.20、163.36、157.93、133.79、129.73、114.22、105.76、101.09、97.58、95.26、77.61、77.28、77.08、72.31、70.97、70.86、69.91、68.80、60.76、55.44、46.04、29.64、18.58。
4e（棕黄色固体）：熔点207.4～211.7 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.32（s, 2H）、6.87～6.83（m, 2H）、6.74（dd,J＝8.2, 2.0 Hz, 1H）、6.01（s, 2H）、5.36～5.27（m, 1H）、5.17～5.01（m, 3H）、4.68（dd,J＝11.5, 4.5 Hz, 2H）、4.58（s, 1H）、4.48（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.72（d,J＝7.5 Hz, 6H）、3.70～3.64（m, 4H）、3.54（d,J＝7.6 Hz, 1H）、3.49～3.45（m, 3H）、3.34～3.26（m, 2H）、3.20（dp,J＝9.6, 4.9, 4.2 Hz, 2H）、2.83（dd,J＝8.3, 6.6 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.1 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.47、164.20、163.36、149.09、147.49、134.42、120.49、112.82、112.41、105.80、101.08、97.60、95.27、77.63、77.29、77.06、72.32、71.00、70.86、69.93、68.79、60.75、56.00、55.86、46.03、30.21、18.61。
4f（黄色固体）：熔点147.4～151.5 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.32（s, 2H）、6.56（s, 2H）、6.02（s, 2H）、5.34～5.28（m, 1H）、5.19～4.99（m, 3H）、4.68（dd,J＝11.3, 4.5 Hz, 2H）、4.57（s, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.75（s, 6H）、3.68（ddd,J＝12.2, 6.1, 2.7 Hz, 2H）、3.62（s, 3H）、3.45（dt,J＝6.7, 3.2 Hz, 2H）、3.33（d,J＝10.4 Hz, 6H）、3.21（tt,J＝10.1, 5.1 Hz, 2H）、2.84（dd,J＝8.6, 6.9 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.40、164.18、163.38、153.19、137.68、136.09、106.04、105.85、101.10、97.57、95.26、77.61、77.29、77.09、72.30、70.98、70.86、69.91、68.80、60.76、60.43、56.23、45.86、31.01、18.60。
4g（白色固体）：熔点146.7～150.8 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.31（s, 2H）、8.68（s, 1H）、6.80（d,J＝1.9 Hz, 1H）、6.70～6.58（m, 2H）、6.01（s, 2H）、5.32～5.28（m, 1H）、5.14～5.01（m, 3H）、4.67（dd,J＝9.5, 4.5 Hz, 2H）、4.56（d,J＝5.6 Hz, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.73（s, 3H）、3.68（ddd,J＝12.8, 7.9, 5.2 Hz, 3H）、3.56～3.47（m, 1H）、3.45（dt,J＝6.2, 2.9 Hz, 2H）、3.28（dd,J＝8.8, 7.1 Hz, 2H）、3.19（td,J＝9.5, 4.8 Hz, 2H）、2.79（dd,J＝8.5, 6.7 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.58、163.35、147.86、145.03、132.71、120.80、115.78、113.05、105.81、101.09、97.57、95.25、77.62、77.29、77.08、72.31、70.98、70.86、69.91、68.80、55.99、46.19、30.26、18.60。
4h（白色固体）：熔点151.3～155.6 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.32（s, 2H）、9.27（s, 1H）、7.06（t,J＝7.8 Hz, 1H）、6.69～6.51（m, 4H）、6.02（s, 2H）、5.36～5.26（m, 1H）、5.15～5.01（m, 3H）、4.67（dd,J＝10.1, 4.5 Hz, 2H）、4.61～4.54（m, 1H）、4.48（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.74～3.63（m, 3H）、3.54～3.41（m, 3H）、3.30（td,J＝7.9, 6.9, 2.7 Hz, 2H）、3.20（dp,J＝9.5, 5.2 Hz, 2H）、2.81（t,J＝7.7 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ201.33、159.63、157.76、149.56、144.15、129.71、119.42、115.65、113.28、106.25、101.09、98.20、94.90、78.07、76.68、76.59、73.20、72.09、71.28、70.00、68.80、61.68、45.09、29.94、18.60。
4i（橙黄色固体）：熔点150.6～156.7 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.38（s, 2H）、9.42（s, 1H）、7.17～7.02（m, 2H）、6.86～6.72（m, 2H）、6.05（s, 2H）、5.37（d,J＝4.3 Hz, 1H）、5.16（td,J＝17.0, 15.3, 9.6 Hz, 3H）、4.84～4.50（m, 4H）、4.09（q,J＝7.2 Hz, 1H）、3.73（d,J＝15.2 Hz, 3H）、3.59～3.47（m, 5H）、3.30～3.24（m, 2H）、2.88（t,J＝7.6 Hz, 2H）、1.24（s, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ210.42、165.63、164.19、155.66、130.26、128.06、127.38、119.34、115.38、98.00、95.37、80.62、78.41、77.42、73.10、71.60、70.12、68.78、60.12、46.46、35.93、32.60、28.85、25.12、18.58。
4j（灰白色固体）：熔点144.8～149.2 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.30（s, 2H）、7.31～7.22（m, 3H）、7.20～7.15（m, 1H）、6.02（s, 2H）、5.33～5.27（m, 1H）、5.14～5.03（m, 3H）、4.67（dd,J＝9.4, 4.6 Hz, 2H）、4.56（t,J＝5.7 Hz, 1H）、4.47（d,J＝5.9 Hz, 1H）、3.68（td,J＝6.3, 3.5 Hz, 2H）、3.51～3.42（m, 2H）、3.32（d,J＝6.3 Hz, 6H）、3.20（tt,J＝9.4, 5.4 Hz, 2H）、2.90（dd,J＝8.4, 6.9 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.26、164.20、163.39、141.98、128.80、126.31、105.74、101.09、97.57、95.28、77.61、77.29、77.08、72.31、70.97、70.86、69.91、68.80、60.75、45.70、30.48、18.60。
4k（灰白色固体）：熔点144.1～149.7 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.33（s, 2H）、7.31～7.23（m, 3H）、7.21～7.00（m, 1H）、6.01（d,J＝1.7 Hz, 2H）、5.31（d,J＝5.1 Hz, 1H）、5.19～5.00（m, 3H）、4.67（dd,J＝8.9, 4.3 Hz, 2H）、4.57（s, 1H）、4.47（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.77～3.61（m, 4H）、3.50～3.42（m, 6H）、3.21（dd,J＝9.8, 4.0 Hz, 2H）、2.89（td,J＝7.7, 3.7 Hz, 2H）、1.17（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.23、164.27、163.41、142.00、130.60、130.52、128.80、126.31、115.53、115.32、105.77、101.09、97.58、95.24、77.62、77.30、77.07、72.31、70.98、70.86、69.91、68.80、60.75、45.70、30.50、29.59、18.60。
4l（灰白色固体）：熔点145.8～148.9 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.31（s, 2H）、7.30～7.23（m, 3H）、7.21～7.16（m, 1H）、6.02（s, 2H）、5.35～5.29（m, 1H）、5.13（d,J＝5.5 Hz, 1H）、5.10～5.02（m, 2H）、4.68（dd,J＝9.2, 4.5 Hz, 2H）、4.58（t,J＝5.7 Hz, 1H）、4.49（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.74～3.62（m, 3H）、3.53～3.41（m, 3H）、3.35～3.29（m, 4H）、3.20（tt,J＝9.5, 5.2 Hz, 2H）、2.90（t,J＝7.7 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.27、164.20、163.40、141.98、128.80、126.31、105.75、101.09、97.57、95.28、77.62、77.31、77.07、72.31、70.98、70.87、69.91、68.80、60.75、45.69、30.49、18.61。
4m（灰白色固体）：熔点145.7～150.1 ℃；
1H NMR（400 MHz，DMSO）δ12.31（s, 2H）、7.36～7.22（m, 2H）、7.13～7.06（m, 1H）、7.05～6.97（m, 1H）、6.01（s, 2H）、5.37～5.27（m, 1H）、5.16～5.02（m, 3H）、4.68（dd,J＝9.4, 4.5 Hz, 2H）、4.57（d,J＝5.6 Hz, 1H）、4.49（d,J＝5.8 Hz, 1H）、3.68（dp,J＝12.0, 5.7 Hz, 3H）、3.53～3.41（m, 3H）、3.31（d,J＝9.1 Hz, 2H）、3.20（tt,J＝9.5, 5.1 Hz, 2H）、2.91（q,J＝7.7 Hz, 2H）、1.18（d,J＝6.2 Hz, 3H）；
13C NMR（101 MHz，DMSO）δ205.12、164.23、163.89、163.43、160.98、150.42、142.74、129.20、116.01、115.06、113.19、112.38、105.75、102.06、97.94、95.27、77.62、77.30、77.07、72.31、70.98、70.87、69.91、67.75、60.75、46.47、45.31、30.49、30.12、18.61。
1.3.2 细胞毒性测试
采用MTT法测定4a～4m对人肾皮质近曲小管上皮细胞HK2细胞的毒性。选用含有10%胎牛血清的MEM培养基培养细胞，显微镜下观察细胞生长程度，收集对数期细胞，配制细胞悬液，浓度为5×104个细胞/mL，每孔100 μL加于96 孔板中。4a～4m的溶液浓度梯度设置为100、200、300、400 μmol/L。按MTT法使用酶标仪在570 nm处测量药物组和对照组（不加药）的吸光度，计算细胞存活率[24]。
1.3.3 甜味评价
1.3.3.1 对照品溶液配制
参照GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[25]，通过感官法初步确定对照品NarDC、NHDC、HDC-7-G、三叶苷、根皮苷对应“无味”、“弱甜味”和“较强甜味”3 个描述词的浓度值，并根据此范围设置5 个二氢查耳酮对照品的待测浓度系列，如表1所示。
蔗糖对照品配制14.7、29.5、74.5、153.4、236.9、324.6 mmol/L的系列溶液。
表1 5种二氢查耳酮对照品溶液的配制Table 1 Preparation of five dihydrochalcone standard solutions
1.3.3.2 感官评价
参照FP法[26]，评价员对6种对照品和4a～4m的系列溶液进行味道评价。4a～4m浓度取值依据1.3.2节MTT法实验，取0.10、0.20、0.40 mmol/L。感官描述分成3 级：“无味”、“弱甜味”和“较强甜味”，在对照品的参照下确定4a～4m在3 个浓度下感官法评价是否有甜味。
1.3.3.3 电子舌评价
基于1.3.3.2节的感官实验评价结果，采用配有甜味脂质膜传感器（GL1）和Ag/AgCl参比电极的电子舌测定待测溶液的甜味信号值[20]。
1.4 数据处理与分析
1H NMR和13C NMR谱图采用MestReNova 14.0软件解析。电子舌电势值测定数据用Insent自带软件转换为甜味值，Excel进行统计分析，Origin软件绘图。GraphPad Prism 5软件用于绘制细胞毒性评价的相关柱形图。
2.1 二氢查耳酮衍生物的合成
为探讨二氢查耳酮A环和B环上的取代基对该类化合物甜味的影响，以天然柚皮苷为起始原料，制备了B环引入甲基、甲氧基、羟基、卤原子的13种衍生物（4a～4m）。在Claisen-Schmidt缩合和O-Michael加成步骤中，由于根皮乙酰苯-4’-β-新橙皮苷在A环上原有的糖基即可作为保护基团，避免A环受到羰基的电子效应影响转化成醌式结构、羰基转化成烯醇式结构而不能发生缩合反应[27]，从而顺利发生缩合和加成获得3a～3m。然后，在弱碱条件下3a～3m经Pd/C催化加氢还原得到4a～4m，此时碱用量以5% NaOH为适宜，过高则生成极性较大的物质，未能检测出目标产物。
2.2 细胞毒性评价
为研究目标化合物的毒性，采用MTT法考察不同浓度的目标化合物（4a～4m）对HK2细胞存活率的影响，结果如图3所示。当化合物4a～4m浓度不高于400 μmol/L时，细胞存活率均大于80%。结果表明，4a～4m对HK2细胞均不具有明显的毒性。
图3 4a～4m对HK2细胞存活率的影响Fig. 3 Effect of dihydrochalone glycosides on viability of HK2 cells
2.3 感官评价和电子舌评价
以感官评价法预确定了对照品和4a～4m相应于“无甜味”、“弱甜味”、“较强甜味”3 个甜味描述词的浓度值，结果如表2所示。选取所得到的浓度值，以电子舌测定6种对照品和4a～4m的甜味值，结果如图4、5所示。
表2 感官评价法预确定对照品和化合物（4a～4m）对应不同甜味描述词的浓度Table 2 Concentrations of dihydrochalone standards and dihydrochalone glycosides corresponding to different sweetness descriptors predetermined by sensory evaluation
由图4可知，在表2中“弱甜味”的浓度下，HDC-7-G在0.04 mmol/L时电子舌甜味值为2.96，三叶苷0.60 mmol/L时甜味值为4.00，蔗糖29.50 mmol/L时甜味值为3.02，均高于呈苦味的根皮苷甜味值（0.2～1.0 mmol/L为1.13～2.15）。以上3种甜味对照品在电子舌甜味值小于3时人不能口尝出相应溶液的甜味，说明电子舌GL1的响应合理，与感官评价结果一致。单糖苷的三叶苷和HDC-7-G（均带有4-葡萄糖基）的甜味值低于其相应甜味更强的双糖苷NarDC和NHDC（均带有4-新橙皮糖基）（图4a、c）；
根皮苷是带有6-葡萄糖基的单糖苷，其B环与三叶苷、NarDC相同，但甜味值更低。可见，B环相同时，GL1可区分二氢查耳酮糖苷A环上的糖基是在4位还是6位，连接的是葡萄糖基还是新橙皮糖基。
图4 对照品的电子舌甜味值测定Fig. 4 Sweetness values of reference substances determined by electronic tongue
GL1对不同化合物的响应灵敏度不同。从图5可知，在相应表2“弱甜味”的浓度时，呈甜味的4a、4b、4h、4j～4m电子舌甜味值为5.92～15.01；
“无甜味”的4d～4g、4i和呈苦味的4c甜味值为1.57～5.56；
5种甜味对照品甜味值为2.92～8.16（图4a～c）。可见，GL1对此类呈甜味衍生物的响应值基本在合理范围内。实验过程中发现，使用同一根GL1测不同化合物的溶液会造成响应值重复性欠佳。
图5 4a～4m的电子舌甜味值测定Fig. 5 Sweetness values of dihydrochalone glycosides determined by electronic tongue
2.4 甜味构效关系
2.4.1 A环糖基的影响
由表2可知，A环上带4-新橙皮糖基或4-葡萄糖基的二氢查耳酮糖苷，有呈甜味的NarDC、NHDC、三叶苷、HDC-7-G、4h、4j、4k，亦有呈苦味的4c和无味的4i、4d、4e。可见二氢查耳酮糖苷呈味与A环的4-糖基并没有明确关系，尚取决于B环的取代情况。NarDC、三叶苷和NHDC、HDC-7-G的B环结构两两相同，NarDC、三叶苷的B环有4’-OH取代，NHDC、HDC-7-G同时有3’-OH和4’-OCH3取代。由表2可以看出，A环有4-新橙皮糖基的NarDC和NHDC的甜味皆比相应B环相同、A环带有4-葡萄糖基的三叶苷和HDC-7-G强得多。换言之，对于B环相同、A环4位有糖基取代的二氢查耳酮糖苷，新橙皮糖苷比单葡萄糖苷甜得多。三叶苷和根皮苷的B环相同，均为4’-OH取代，但是A环上葡萄糖基的取代位置不同。由表2可知，有4-葡萄糖基的三叶苷呈甜味，而连有6-葡萄糖基的根皮苷却呈苦味，表明二氢查耳酮糖苷的呈味与A环糖基取代的位置有关。
2.4.2 B环的影响
合成的4a～4m均为新橙皮糖苷。由表2可知，4a、4b、4h、4j～4m呈不同程度的甜味，4d～4g、4i没有甜味，4c呈苦味，可见B环上基团的差异会影响二氢查耳酮糖苷的呈味。其中，4g（3’-OCH3，4’-OH）与NHDC（3’-OH，4’-OCH3）的分子结构区别仅在于B环上3’位和4’位基团的互换，前者没有甜味，而后者具有强烈的甜味。呈甜味的4h（3’-OH）与NHDC结构差异在于后者多了4’-OCH3，表明4’-OCH3具有强烈增甜作用。4h和NarDC（4’-OH）均有“较强甜味”，两者差异在于B环—OH的位点不同。无甜味的4g（3’-OCH3、4’-OH）与NarDC（4’-OH）差异在于前者多了3’-OCH3，表明是4’-OH相邻的3’-OCH3有去甜作用。而4b（3’,5’-CH3、4’-OH）甜味明显低于NarDC（4’-OH），显然是前者在4’-OH旁边的两个—CH3使甜味大大减弱。可见4’-OH相邻的—CH3有降甜作用（4b）。4c（4’-CH3）呈苦味，与有甜味的4a（2’～6’位均无取代）比较，可说明4’-CH3具致苦作用；
仅有—OCH3一种取代基但个数不同的4d（4’-OCH3）、4e（3’,4’-OCH3）、4f（3’,4’,5’-OCH3）均不呈甜味，与4a比较可说明B环3’,4’,5’位上仅有同一种取代基时—OCH3有去甜作用。4i（2’-OH）无甜味，卤原子取代的4j（4’-Cl）、4l（3’-Cl）、4k（4’-F）、4m（3’-F）呈“较强甜味”。与4a相比可知，B环2’位的OH对甜味没贡献。以上均说明B环3’位和4’位的取代基对二氢查耳酮的呈味至关重要。当B环2’～6’位无取代，或3’位、4’位仅连有OH、F、Cl之一，此7种化合物均可呈甜味。
2.4.3 结构-甜味效应机理探讨
Tinti等[28]的多点结合甜味理论认为，人体甜味蛋白受体至少包含8 个基本识别部位，与甜味分子的结合部位相互作用产生甜味刺激。甜味分子与受体蛋白相互作用结合部位的数量和结合的有效程度决定了该甜味分子的甜度强弱，而结合的有效程度与甜味分子大小、立体空间构型、活性基团的化学性质有很大关系。对物质甜味感知的差异取决于甜味受体的结构变化，Winnig等[12,29]通过对大鼠和人的两个与甜味有关的G蛋白偶联受体Tas1R2（taste receptor type 1 member 2）和Tas1R3（taste receptor type 1 member 3）的种间组合和嵌合体的分析，认为人Tas1R3的七肽结构域似乎与NHDC甜味受体的激活密切相关，并鉴定了一组不同的氨基酸残基，从而形成NHDC结合口袋。AH-B受体结合理论认为，所有甜味化合物都含有一个氢键供体（AH）和一个氢键受体（B），分别与受体上互补的受体（B）、供体（AH）相互作用，形成两个氢键和/或阻断受体蛋白上的分子内氢键而引发了甜味的感知[30]。
综上可知，甜味分子与受体蛋白的氢键作用对甜味感知有重要影响。呈甜味的NHDC、NarDC、4h的B环上3’位或4’位取代基—OH既可作为氢键受体也可作为氢键供体，易于与受体蛋白上的氨基酸残基作用形成氢键；
呈甜味的4j～4m，B环上3’位或4’位带有的F或Cl可作为氢键受体形成氢键。4i不呈甜味，原因是B环上的2’-OH形成氢键有较大的空间位阻；
4c的4’-CH3不能参与氢键形成，事实上4c呈苦味。4d（4’-OCH3）、4e（3’,4’-OCH3）、4f（3’,4’,5’-OCH3）均不呈甜味，它们的B环上仅有一种甲氧基，没有任何羟基。甲氧基虽然可以作为氢键受体，但由于甲基的位阻导致形成的氢键较弱。4b甜味明显低于NarDC，显然是前者在4’-OH旁边的两个—CH3产生的位阻使4’-OH形成氢键的能力下降，导致甜味减弱。可见，当B环上取代基为较强的氢键供体或受体，可与甜味受体蛋白形成较强的氢键，二氢查耳酮糖苷的甜味较强，3’位、4’位的取代基对二氢查耳酮呈味有较大影响。
合成了4a～4m共13 个二氢查耳酮衍生物，其中4a～4c、4j、4k、4e、4f、4l、4m为新化合物，目前鲜见文献报道。MTT法测定结果表明，4a～4m对HK2细胞没有明显毒性作用。以甜味的NHDC、NarDC、HDC-7-G、三叶苷、蔗糖和苦味的根皮苷作为对照品，用感官法和电子舌分别对4a～4m进行甜味评价。确认4a、4b、4h、4j～4m呈甜味，4d～4g和4i没有甜味，4c呈苦味。对于人感官口尝有甜味的衍生物，电子舌的测定结果与感官评价法基本吻合。基于甜味评价结果，分析了包括5 个二氢查耳酮对照品和13 个衍生物的结构与甜味的相关性。在前人的甜味构效研究基础上探讨甜味分子与受体蛋白的氢键作用对甜味感知的影响。结果表明，二氢查耳酮糖苷的呈味与A环糖基的取代位点有关；
与A环的4-糖基（新橙皮糖基/葡萄糖基）没有明确关联，尚取决于B环的取代情况。新橙皮糖苷呈味与B环3’、4’位的取代基有明确关联，B环上2’～6’位无取代，或3’位、4’位仅连有OH、F、Cl之一，可呈甜味。—CH3、—OCH3不是产生甜味的关键基团。下一步将设计合成更多的二氢查耳酮衍生物，以深入研究其甜味构效关系。
——以高中化学“氢键”的教学为例教学月刊（中学版）(2020年13期)2020-12-29研究人员实现生物质中氢键裁剪与重构杭州化工(2020年2期)2020-01-16橙皮糖幸福·健康版(2018年3期)2018-03-23橙皮糖食品与健康(2017年9期)2017-09-13“营养高手”橙皮酱恋爱婚姻家庭·养生版(2017年2期)2017-02-15