郑秋桦，李富鑫，刘广源，庞彦韬，黎晓漩，曾松荣
（韶关学院 英东生物与农业学院，广东 韶关 512005）
矿业废弃地一般是指矿山开采活动产生的废石和选矿产生的尾矿等大量堆存，没有经过整治而无法使用的土地。这些废石和尾矿等经风化淋滤后会将有害的重金属转移到土壤中，造成矿业废弃地土壤酸化、重金属毒性和氮、磷、钾等营养元素缺乏，植物无法生长。这种裸露的矿业废弃地因缺乏植被覆盖，水土流失严重，会成为持久的污染源，对下游及周边地区环境造成影响，导致严重的环境污染问题，并可能通过食物链危及人类健康。矿业废弃地的生态恢复已成为我国当前所面临的紧迫任务之一，其修复的关键是植被恢复，因为植被恢复能够增加地表稳定性，控制重金属和水土流失，还能改善土壤的营养状况。同时，植被恢复后的土壤中的重金属还避开了食物链，不会影响人体健康，因而植被恢复具有良好的环境、生态、社会和经济多方面的综合效益。然而废石堆和尾矿库等矿业废弃地因为严重酸化、重金属毒性和养分缺乏等众多的理化因素，限制了植物在废弃地上定居和生长，植被的自然恢复非常缓慢，只有对其采取积极的人工恢复措施加以干预，才能对土壤的重金属污染进行有效治理[1]。
已有研究表明，植物内生菌可以通过它们自身的代谢活动促进宿主植物生长，提高植物抗逆性，增强植物重金属耐性[2-3]。例如，铁载体是由微生物产生的高亲和力低分子量的金属螯合剂，除了螯合Fe 外，铁载体还可与Pb、Zn 和Cr 等重金属离子形成配合物，影响重金属的存在方式，有利于植物根系对Fe等元素的吸收，促进植物生长发育[4-6]。磷元素在土壤环境中以无机磷和有机磷两种形式为主，而环境中的溶磷微生物可产生特殊物质使土壤的无机磷溶解，从而有利于植物对磷的吸收，促进植物生长。同时，微生物还可以分泌植物生长素吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）等调节植物的生长与发育[7]。
本研究的前期工作中，已从粤北地区凡口铅锌矿废弃地自然生长的优势植物中分离出内生真菌，并筛选出抗铅、锌重金属离子能力较强的抗性菌株。筛选出重金属抗性较强菌株的目的是为了将这些菌株开发成菌剂施用到被重金属污染的矿业废弃地土壤，有利于促生菌株抵御重金属的毒性，并能在土壤中存活，以及能顺利地进入宿主植物中。本研究拟以这些铅、锌重金属抗性菌株为研究对象，筛选出对植物有促生长作用的能产生铁载体、溶磷和IAA 的内生真菌。此项工作的开展可为今后利用植物与其共生的内生真菌联合修复矿区废弃地重金属污染，促进植物在重金属胁迫的不良环境下生长，加快矿业废弃地植被恢复，提高植被覆盖率及防止水土流失奠定一定的基础，对土壤重金属污染的生态治理有着重要意义。
1.1 材料
1.1.1 实验菌株
采集粤北凡口铅锌矿废弃地的优势植物香蒲（Typhaorientalis presl）、苦楝（Melia azedarach）、苎麻（Boehmeria nivea）和蓖麻（Ricinus communis）4 种优势植物，从这些优势植物中分离筛选出具有抗重金属铅、锌能力的植物内生真菌45 个菌株，本研究以这些重金属抗性菌株作为植物促生长菌株筛选的实验菌株。
1.1.2 培养基及主要试剂配制方法
1）无机磷培养基。培养基中各物质的添加量如下：MnSO4·H2O 0.03 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L ，KNO30.76 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，蔗糖10 g/L，Ca3(PO)45.0 g/L。并将培养基的pH 值调整为7.5，配置后在115 ℃温度下灭菌处理30 min。若加入琼脂粉20 g/L，即可作为固体培养基。
2）无铁查氏培养基。培养基中各物质的添加量如下：KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蔗糖30 g/L，NaNO32.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，并于115 ℃温度下灭菌处理30 min。
3）Czapek 培养基。培养基中各物质的添加量如下：KCl 0.5g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.01 g/L，蔗糖30 g/L，NaNO32.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，并于115 ℃下灭菌处理30 min。若加入琼脂粉20 g/L，即可作为固体培养基。
4）PDA（potato dextrose agar）培养基。培养基中各物质的添加量如下：马铃薯200 g/L，蔗糖20 g/L，琼脂粉15～20 g/L，并于115 ℃下灭菌处理30 min。
5）PDB（potato dextrose broth）培养基。培养基中各物质的添加量如下：马铃薯200 g/L，蔗糖20 g/L，并于115 ℃下灭菌处理30 min。
6）含氨苄青霉素的LB（luria-bertani）培养基。培养基中各物质的添加量如下：NaCl 10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L，并于121℃下灭菌处理20 min。待培养基冷却至55～60 ℃时，加入适量无菌氨苄青霉素溶液，使培养基中氨苄青霉素的最终质量浓度为100 mg/mL。若在此基础上加入15～20 g/L 的琼脂粉，则可配制成固体培养基。
7）CAS（chromeazurol S）检测液的配制。首先称取60.5 mg 铬天青S 并加入到50 mL 蒸馏水中，待完全溶解后倒入10 mL 浓度为1 mmol/L 的氯化铁和10 mmol/L 的盐酸，混合摇匀作为A 液；
再量取72.9 mg 十六氨基烷基溴化铵加入到40 mL 蒸馏水中，并在45 ℃水浴锅中加热溶解至澄清透亮，作为B 液，将A 液和B 液混合均匀即可得到CAS 检测液。
8）钼锑抗比色法试剂的配制。①钼锑储备液的配置：量取200 mL 蒸馏水倒入烧杯中，将烧杯放置在冷水中，然后沿着烧杯内壁边搅拌边缓慢加入76.5 mL 浓硫酸，冷却待用。称取5 g 钼酸铵溶于150 mL蒸馏水中，将冷却后的硫酸溶液缓慢倒入与钼酸铵溶液混匀，再用移液管吸取50 mL 质量浓度为5 g/L 的酒石酸锑钾溶液与硫酸钼酸铵混合液混匀，最后定容至500 mL。②钼锑抗混合显色剂的配置：称取750 mg 左旋抗坏血酸于烧杯中，并加入50 mL 上述已经配制好的钼锑储备液，搅拌均匀后保存在棕色瓶中，此溶液的有效期为1 d。
9）Salkowski 试剂的配制。称取1.2 g 氯化铁置于烧杯中，然后加入30 mL 蒸馏水搅拌溶解，之后边搅拌边沿着烧杯内壁缓缓倒入42.97 mL 浓硫酸，冷却定容至100 mL。
1.1.3 药品与试剂
UNIQ-10 柱式真菌基因组抽提试剂盒、PCR（polymerase chain reaction）扩增试剂盒和SanPrep柱式PCR 产物纯化试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
pEASY-Blunt Cloning Kit 试剂盒和Trans1-T1 感受态细胞，购自北京全式金生物技术股份有限公司；
L-色氨酸和吲哚乙酸，购自上海展云化工有限公司；
磷单元素标准溶液，购自钢研纳克检测技术股份有限公司。硫酸锰、硫酸镁、硝酸钾、硫酸亚铁、硝酸铅、磷酸钙等均为国产试剂，分析纯。
1.2 方法
1.2.1 产铁载体菌株的筛选及活力测定[8-9]
1）产铁载体菌株的初筛选。往每支试管中添加无铁查氏液体培养基5 mL，并用115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。冷却后，把供试的内生真菌菌株接种至培养基中，以空白培养基为对照，一同放置在28 ℃恒温培养箱中培养7 d，然后吸取150 μL 培养液和等体积的CAS 检测液于96 孔板中混匀，静置1 min，观察结果。以空白培养基和等体积的CAS 检测液混匀后为阴性对照，结果显示为蓝色；
以饱和EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid）溶液和等体积CAS 检测液混匀后为阳性对照，结果显示为红色。若实验组显示为蓝色，则说明培养液不含铁载体，表明该菌株不产生铁载体；
若实验组显示为红色或紫色，则说明培养液中含有铁载体，表明该菌株产生铁载体。
2）铁载体活力测定。把初筛获得的产铁载体阳性菌株转接到无铁查氏液体培养基中，在28 ℃、160 r/min 摇瓶培养7 d，然后滤纸过滤，保留滤液。量取该过滤液5 mL，与等体积CAS 检测液混匀，室内静置1 h，然后用蒸馏水调零，以分光光度计测定其OD680值，记为“As”；
用相同方法测定对照样品的OD680值，记为“Ar”，对照样品为空白培养基与等体积CAS 检测液混合的混合液。SU（Siderophoreunit）表示铁载体活力大小，且SU=[(Ar-As)/Ar]×100%。若As/Ar<0.5，则表明菌株有较好的产铁载体功能。
3）铁载体化学结构检测。将5 mL 过滤液与等体积的质量分数为2%的氯化铁溶液混匀，若在420～450 nm 处有吸收值，则表明培养液中含有异羟肟酸型铁载体。将5 mL 过滤液与等体积的质量分数为2%的氯化铁溶液混匀，若在495 nm 处有吸收值，则表明培养液中含有儿茶酚型铁载体。量取3 mL 的过滤液，并添加1 mL 浓度为250 mmol/L 的硫酸铜溶液和2 mL pH 值为4 的醋酸钠缓冲液混匀，若在190～280 nm 处有吸收值，则表明溶液中含有羧酸型铁载体。
1.2.2 溶磷菌株的筛选及定量测定
1）溶磷菌株的初筛。将菌株分别接种到无机磷平板上，于28 ℃下恒温培养7 d，然后用游标卡尺测量菌落直径（d）及溶磷圈直径（D）。若D/d>1，则表明该菌株有较好的溶磷效果[10]。
2）有效磷标准曲线的制作。用质量浓度为100µg/mL 的磷标准液，分别配制出0,10,20,30,40,50,60 µg/mL 的梯度溶液，用钼锑抗比色法测出其OD660值，绘制有效磷标准曲线。
3）溶磷菌株的定量测定[11]。将初筛获得的菌株接种到无机磷液体培养基中，以空白培养基作为对照。将接种的摇瓶在28 ℃、160 r/min 摇床培养9 d。每天用pH 计测定培养液的pH 值，并用钼锑抗比色法测定培养液的OD660值，连续测定9 d。最后根据有效磷标准曲线求出有效磷浓度。
1.2.3 产吲哚乙酸（IAA）菌株的筛选及含量测定
1）产IAA 菌株的筛选。在已灭菌的盛有5 mL Czapek 培养基的试管中，添加100 µL 浓度为50 mmol/L 过滤除菌的L-色氨酸溶液，轻微摇匀，使培养基中L-色氨酸的质量浓度为0.5 mg/mL，并接种菌株。以空白培养基为对照组，在28 ℃下恒温培养7 d，然后吸取150 µL Salkowski 液和等量的培养液加入96 孔板中混匀，避光20 min 后观察并记录最终的颜色。空白培养基为阴性对照，并以质量浓度为20 mg/L 的吲哚乙酸为阳性对照。溶液颜色变化越深，表明IAA 浓度越高[12-13]。
2）IAA 的标准曲线制作。配制质量浓度依次为0,0.1,0.5,5.0,10.0,15.0,20.0 mg/L 的吲哚乙酸溶液，加入等体积Salkowski 溶液混匀，避光30 min。然后用分光光度计以蒸馏水加等量Salkowski 液调零，测定混合液的OD530值，绘制IAA 标准曲线。
3）IAA 的定量测定。把初筛得到的菌株接种到Czapek 培养基中，并且以空白培养基为对照组，在28 ℃、160 r/min 摇床培养7 d。滤纸过滤除菌丝体，保留上清液。吸取3 mL 上清液和等量Salkowski 液混匀，避光30 min 后用分光光度计测定其OD530值。根据IAA 标准曲线求出培养液中IAA 浓度[12-13]。
1.2.4 菌株的形态学鉴定
选取产铁载体、溶磷和产IAA 能力较强的菌株作为代表性菌株，采用三点接法接种在Czapek 平板，28 ℃下恒温培养57 d。依据光学显微镜所观察到的菌株个体形态特征并结合其菌落形态特征，参照魏景超的《真菌鉴定手册》进行初步鉴定。
1.2.5 植物内生菌的ITS 序列分析
对产铁载体、溶磷和产IAA 能力较强的菌株做ITS 序列分析，以确定其种属关系。
采用UNIQ-10 柱式真菌基因组抽提试剂盒抽提供试菌株的基因组，通过PCR 技术扩增目的基因，再用SanPrep 柱式PCR 产物纯化试剂盒，对PCR 产物进行回收。回收后，用pEASY-Blunt Cloning Kit试剂盒构建重组载体，并转化至 Tans1-T1 感受态细胞中。转化结束后进行抗氨苄青霉素筛选。把抗性细菌进行菌液PCR，若存在目的基因，则把菌液制作成冻存管送至生工生物工程（上海）股份有限公司广州分公司做ITS 序列测定。
用BioEdit 剪切获取ITS 序列，输入NCBI（National Coalition Building Institute）数据库中Blast，选出相似度较高的基因序列。用MEGA7.0 进行多序列比对，采用邻接法获得目的菌株的系统发育树，进而确定其种属关系。
2.1 产铁载体菌株的筛选
2.1.1 初筛结果
在实验组的45 个植物内生真菌菌株中，显示红色的说明培养液中含有铁载体，所得实验结果如图1所示，共筛选得到可以分泌产生铁载体的菌株32 个。
图1 45 个菌株产铁载体初筛结果Fig.1 Preliminary screening results of 45 strains of producing iron carriers
图1中，第一列为阴性对照组，第二列为阳性对照组，自A3 从左到右对应的菌株为XP3.2、XP3.3、XP3.4、XP3.14、XP3.17、XP3.18、XP3.20、XP4.1、XP4.5、XP4.7；
自B3 从左到右对应的菌株为XP4.8、XP4.10、XP6.1；
自C3 从左到右对应的菌株为XP2.1、XP2.8、XP2.9、XP3.21、XP4.3、XP4.12、XP4.30、XP5.4；
自D3 从左到右对应的菌株为WB-2、WB-3、WB-7、WB-9、WB-12、WB-14、WB-21、WB-22、WB-23；
自E3 从左到右对应的菌株为ZMP5-2、ZMP5-3、ZMP7-2、ZMZ5-3、ZMZ5-5、ZMZ5-7、ZMZ6-2、ZMZ6-5、ZMZ7-2；
自F3 从左到右对应的菌株为BM1、BM2、BM3、BM4、BM5、BM6。
2.1.2 铁载体活力测定与化学结构分析
对经过初筛得到的32 个菌株再次进行筛选，发现菌株ZMP7-2 和BM6 为假阳性菌株，其余30 个菌株产铁载体活力与铁载体化学结构测定结果见表1。
表1 30 个阳性菌株铁载体活力测定及类型鉴定结果Table 1 Determination results of iron carrier activity with the type identification of 30 positive isolates
由表1可知，根据比较As/Ar值发现，除XP2.9 外，其余菌株的As/Ar<0.5，表明有29 个菌株能产生活性较好的铁载体分子。同时，除XP3.18 菌株外，其余29 个菌株所产的铁载体主要类型为异羟肟酸型和儿茶酚型，或两种铁载体同时兼具型，这表明植物内生菌可以产生一种或多种不同类型的铁载体。
2.2 溶磷菌株的筛选
经溶磷圈法筛选到3 个具有较好的溶磷作用的菌株，分别是菌株XP3.17、WB-7 和WB-21，结果如图2所示，平板中菌落边缘的透明圈即为溶磷圈。
图2 菌株XP3.17、WB-7 和WB-21 溶磷筛选结果Fig.2 Screening results of phosphorus soluble strains XP3.17,WB-7 and WB-21
选取代表性菌株XP3.17 测定其有效磷浓度。菌株XP3.17 培养液中有效磷及pH 值变化曲线见图3，可知培养液有效磷最大质量浓度为72.864 μg/mL，最低pH 值为3.80。
图3 菌株XP3.17 溶磷能力测定Fig.3 Determination of phosphorus solubility of strain XP3.17
从图3可知，随着培养时间延长，培养液pH 值从第2 d 开始快速下降，在第4 d 后趋于平缓，不再发生剧烈变化，然而有效磷浓度却随着培养时间延长而增加，并在第6 d 达到最大值。这一结果表明，XP3.17 菌株在培养过程中通过代谢产生了某种酸性物质，引起培养液的pH 值下降。然而有效磷浓度会随着pH 值的下降而上升，表明了引起pH 值下降的酸性物质可以有效地溶解磷酸钙，这就表明植物内生菌溶磷能力与其代谢产生的酸性物质存在一定关系。
2.3 产IAA 菌株的筛选
将培养液与等体积Salkowski 液混合均匀，静置30 min 后的显色结果如图4所示，参照该图第2 列的阳性对照，共筛选到18 个具有产IAA 能力的菌株。
图4 45 个菌株中产IAA 菌株的筛选结果Fig.4 Screening results of 45 strains producing IAA
图4中，第一列为阴性对照组，第二列为阳性对照组，自A3 从左到右对应的菌株依次为XP3.2、XP3.3、XP3.4、XP3.14、XP3.17、XP3.18、XP3.20、XP4.1、XP4.5、XP4.7；
自B3 从左到右对应的菌株依次为XP4.8、XP4.10、XP6.1；
自C3 从左到右对应的菌株依次为XP2.1、XP2.8、XP2.9、XP3.21、XP4.3、XP4.12、XP4.30、XP5.4；
自D3 从左到右对应的菌株依次为WB-2、WB-3、WB-7、WB-9、WB-12、WB-14、WB-21、WB-22、WB-23；
自E3 从左到右对应的菌株依次为ZMP5-2、ZMP5-3、ZMP7-2、ZMZ5-3、ZMZ5-5、ZMZ5-7、ZMZ6-2、ZMZ6-5、ZMZ7-2；
自F3 从左到右对应的菌株依次为BM1、BM2、BM3、BM4、BM5、BM6。
根据IAA 标准曲线求得培养液IAA 浓度，结果如表2所示。
表2 培养液IAA 浓度Table 2 IAA concentration of the culture medium
2.4 菌株的形态学鉴定
选取部分产铁载体、溶磷和产IAA 能力较强的菌株进行个体形态特征观察及鉴定，显微镜下观察到的部分菌株的个体形态（40×10）如图5所示。
图5中，根据菌株形态，将菌株WB-21、BM3和BM5 分别鉴定为曲霉属（Aspergillus）、旋孢腔菌属（Cochliobolus）、链格孢属（Alternaria）。菌株XP3.21 和ZMP5-3 特征不明显，故暂时不能通过形态特征确定其种属关系，需要进一步分析以确定其种属关系。
图5 部分菌株的个体形态Fig.5 Microscopic individual morphology of selected strains
2.5 ITS 序列分析及系统发育树构建
将上述5 个代表菌株ITS 序列输入NCBI 数据库中Blast，选出相似度较高的基因序列。用MEGA7.0进行多序列比对，采用邻接法获得目的菌株的系统发育树，结果如图6所示。
图6 基于ITS 序列分析构建的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree based on ITS sequence analysis
由图6可知，WB-21 为曲霉属（Aspergillus）、BM3 为旋孢腔菌属（Cochliobolus）、BM5 为链格孢属（Alternaria）、菌株XP3.21 为刺盘孢属（Colletotrichum）、ZMP5-3为篮状菌属（Talaromyces）。可见WB-21、BM3 和BM5 菌株的分子鉴定结果与它们的形态学鉴定结果一致。
通过CAS 检测液显色反应、钼锑抗比色法和Salkowski 法，对在粤北凡口铅锌矿废弃地的4 种优势植物香蒲、苦楝、蓖麻和苎麻中分离筛选出的具有抗铅、锌重金属能力的45 株内生真菌，进行促生作用筛选及对有促生作用较好的代表菌株进行分类鉴定，得出以下结论：
1）在促生菌株筛选方面，得到产铁载体的菌株共30 株，占菌株总数的66.67%；
有溶磷能力的菌株3 株，占菌株总数的6.67%；
产IAA 能力较好的菌株共18 株，占菌株总数的40.00%。
2）不同菌株可以产生不同的代谢产物，同时体现出微生物代谢产物的多样性，对今后继续开发利用植物内生菌资源有着重要的指导作用。
3）通过对促生菌株的代表菌株进行形态学鉴定和ITS 序列分析，鉴定结果显示WB-21 为曲霉属（Aspergillus）、BM3 为旋孢腔菌属（Cochliobolus）、BM5 为链格孢属（Alternaria）、菌株XP3.21 为刺盘孢属（Colletotrichum）、ZMP5-3 为篮状菌属（Talaromyces）。同时这些代表菌株分属于不同的属，表现出一定的多样性。
4）本研究经筛选获得的可以产生铁载体、溶磷和分泌产生IAA 的内生真菌，为今后利用植物-微生物联合修复技术对土壤重金属污染治理提供了理论依据，同时，还可为进一步探究植物内生真菌对植物促生长机理奠定一定的理论基础，并以此推动内生真菌在植物修复重金属污染土壤工程中的应用。
猜你喜欢 废弃地内生培养液 从一道试题再说血细胞计数板的使用中学生物学(2021年8期)2021-11-02矿山废弃地生态修复中3S 技术的应用世界有色金属(2021年1期)2021-04-19基于GIS和层次分析法的采石废弃地景观评价研究——以新乡市凤凰山森林公园为例环境影响评价(2020年5期)2020-12-02植物内生菌在植物病害中的生物防治湖北农机化(2020年4期)2020-07-24内生微生物和其在作物管理中的潜在应用世界农药(2019年4期)2019-12-30“党建+”激活乡村发展内生动力今日农业(2019年11期)2019-08-15调整蔗糖、硼酸和pH值可优化甜樱桃花粉萌发培养液中国果业信息(2019年1期)2019-01-05授人以渔 激活脱贫内生动力乡村地理(2018年2期)2018-09-19不同培养液对大草履虫生长与形态的影响研究中国畜牧兽医文摘(2018年6期)2018-07-28景观都市主义理念下的工业废弃地景观再生研究现代园艺(2018年1期)2018-03-15