王 莹， 卢葛锦， 祝令伟， 关佳瑶， 纪 雪， 孙 洋， 郭学军
(中国农业科学院长春兽医研究所/吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122)
大肠埃希菌是人与动物的肠道共栖菌，不仅包括共生菌株，还包括可引起人畜疾病的致病性菌株，具有显著的多功能性，能够在人类和动物中引起疾病[1]，也被叫做致泻大肠埃希菌 (diarrheogenicEscherichiacoli，简称DEC)，DEC的致病性是其携带的毒力因子所致，这些毒力因子可破坏宿主的防御系统，并在受感染的人和动物中引起腹泻和局部组织感染，严重时甚至引起新生儿的脑膜炎和败血症等严重疾病，是临床感染性疾病的重要食源性致病菌之一[2]，全世界每年因大肠埃希菌病死亡的人数大约有200 万人。DEC根据其携带的毒力基因、引起感染的部位以及引起疾病的原因，可将DEC分为6类：肠产毒素型大肠埃希菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，简称ETEC)、肠致病型大肠埃希菌(enteropathogenicEscherichiacoli，简称EPEC)、肠侵袭型大肠埃希菌(enteroinvasiveEscherichiacoli，简称EIEC)、肠集聚型大肠埃希菌(enteroaggregativeEscherichiacoli，简称EAEC)、肠出血型大肠埃希菌 (enterohemorrhagicEscherichiacoli，简称EHEC )和弥散黏附型大肠埃希菌(diffusely adherent Escherichia coli，DAEC)[3]。为了解长春某规模化养猪场中 DEC的污染情况，本研究对从猪场分离的大肠埃希菌进行系统进化分群和毒力基因检测以及致病型鉴定，并检测了菌株耐药情况，为从猪肉生产源头对DEC污染的防控提供技术依据。
1.1 菌株
129株大肠埃希菌于2020年分离自哺乳仔猪、妊娠母猪、哺乳母猪和断奶仔猪粪便，其中妊娠母猪粪便分离获得36株大肠埃希菌，哺乳母猪分离获得42株大肠埃希菌，哺乳仔猪粪便分离获得30株大肠埃希菌，断奶仔猪粪便分离获得21株大肠埃希菌。
1.2 试剂
脑心液体培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；
琼脂糖，购自美国Genview公司；
DNA分子量标准DL2 000，购自美国TaKaRa公司；
细菌鉴定卡、ID肉汤、AST肉汤和AST指示剂，购自美国BD公司；
6种致泄大肠埃希菌(DEC)核酸检测试剂盒，购自北京美正生物科技有限公司；
引物均由吉林库美生物科技公司合成。
1.3 模板的制备
将冻存管中的菌液接种于脑心固体培养基上，置于37 ℃ 恒温培养箱中倒置培养16 h，挑取至少10个单菌落，加入100 μL 无菌去离子水，混匀，采用煮沸法提取129株待检大肠埃希菌的基因组DNA作为PCR扩增模板。
1.4 系统进化分群检测
参考Clermont 等建立的方法[4]合成引物，通过多重PCR，检测大肠埃希菌分离株系统进化分群。根据扩增结果将大肠埃希菌分为A群系(chuA基因和TspE4.C2基因PCR扩增结果均为阴性)、B1群系(chuA基因PCR扩增结果为阴性而TspE4.C2基因PCR扩增结果为阳性)、B2群系(chuA基因和yjaA基因PCR扩增结果均为阳性)、D群系(chuA基因PCR扩增结果为阳性而yjaA基因PCR扩增结果为阴性)。
表1 试验所需引物
1.5 毒力基因与致病型检测
采用多重荧光实时定量PCR技术检测14种毒力基因，包括aggR、stx1、lt、ipaH、eae、bfpB、stp、afaD、astA、pic、escV、stx2、sth和invE，根据试剂盒说明书，设定PCR扩增条件，检测毒力基因的携带情况，判读DEC的致病型。
1.6 耐药性检测
将分离的菌株接种于脑心固体培养基上，置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养16 h。先将ID肉汤放置于Phoenix SpecTM比浊仪内调零，使用无菌棉签刮取平板划线4区中单菌落于ID肉汤中，将菌液调为麦氏比浊度0.5～0.6范围内，将46 μL AST指示剂垂直滴入AST肉汤，上下颠倒，缓慢混匀加入调好麦氏比浊度的ID肉汤25 μL，再次上下缓慢颠倒混匀，分别将ID肉汤和ASD肉汤缓缓倒入鉴定卡内，把鉴定卡放置于全自动微生物药敏系统内对菌株进行敏感性检测，根据全自动微生物药敏系统检测出的结果对菌株的敏感性及是否为产ESBLs菌株进行判断。
2.1 大肠埃希菌系统进化分群结果
对129株大肠埃希菌分离株系统进化分群分析结果见表2，A群占43.41%，B1群占51.49%，B2群占0.78%，D群占3.86%，B1群为优势群。妊娠母猪分离的36株大肠埃希菌中A群和B1群为优势群，3株大肠埃希菌为D群，未检出B2群；
哺乳母猪分离的42株大肠埃希菌中A群和B1群为优势群，1株大肠埃希菌为B2群，1株大肠埃希菌为D群；
哺乳仔猪分离的30株大肠埃希菌中A群和B1群为优势群，1株大肠埃希菌为B2群，1株大肠埃希菌为D群；
断奶仔猪分离的21株大肠埃希菌中A群和B1群为优势群，未检出B2群和D群。
表2 系统进化分群结果
2.2 大肠埃希菌 14种毒力基因携带情况
14种毒力基因中astA检出率最高，为30.23%；
其次是escV，为5.43%，stp和stx2均为0.78%；
未检出毒力基因bfpB、eae、aggR、stx1、lt、ipaH、afaD、pic、sth和invE。129株大肠埃希菌主要为5种毒力基因组合形式：astA(占29.46%)、escV(占4.65%)、stp(占0.78%)、stx2(占0.78%)、astA-escV(占0.78%)。
2.3 不同种群大肠埃希菌毒力基因的携带情况
不同种群大肠埃希菌所携带的毒力基因存在差异，结果如表3所示。根据毒力基因携带情况进行分析，astA基因在A群、B1群中检出率最高，escV基因在B1、B2群检出率最高，stp基因在仅A群中检出，stx2基因仅在B1群检出。根据不同群系携带毒力基因的情况进行分析，B1群含有检出的3种毒力基因，A群含有检出的2种毒力基因，B2群含有检出的1种毒力基因，D群未检出任何毒力基因。
2.4 大肠埃希菌致病型分析
根据毒力基因的检出情况可以将大肠埃希菌分离株归入不同的致病型，本研究将分离自不同生长周期的大肠埃希菌致病型分布进行归纳，结果如表4所示。妊娠母猪分离的36株大肠埃希菌中DEC占22.22%，其中EAEC检出7株，占19.44%，毒力基因型均为astA；
EHEC检出1株，占2.78%，毒力基因型为stx2。哺乳母猪分离的42株大肠埃希菌中DEC占38.10%，均为EAEC，毒力基因型均为astA。哺乳仔猪分离的30株大肠埃希菌中DEC占33.33%，其中EAEC检出7株，占23.33%，毒力基因型均为astA；
EPEC鉴定出3株，占10.00%，毒力基因型为escV。断奶仔猪分离的21株大肠埃希菌中DEC占61.90%，其中EAEC检出8株，占38.10%，毒力基因型均为astA；
ETEC鉴定出1株，占4.76%，毒力基因型为stp；
EPEC鉴定出3株，占14.29%，毒力基因型为escv；
EAEC-EPEC鉴定出1株，占4.76%，毒力基因型为astA-escV。
表4 猪源DEC毒力基因检出及致病型分布
2.5 耐药结果
2.5.1 大肠埃希菌对17种抗生素耐药表型结果 129株大肠埃希菌中检出产ESBLs菌株25株，检出率为19.38%。由表5可知，不同来源的大肠埃希菌对16种抗生素耐药表型基本相同，均对氨苄西林、哌拉西林、氯霉素和四环素耐药率较高，对阿米卡星和黏菌素耐药率较低，对亚胺培南、美洛培南和头孢他啶无耐药。耐药性检测的抗生素有六大类，包括氨基糖苷类、β-内酰胺类、酰胺醇类、氟喹诺酮类、多黏菌素类和四环素类，根据多重耐药菌的定义，对3类及3类以上抗生素耐药的细菌为多重耐药菌，在129株大肠埃希菌中检出多重耐药菌83株。
2.5.2 DEC对17种抗生素耐药表型结果 分离自妊娠母猪的8株DEC中有4株多重耐药菌，占50.00%；
分离自哺乳母猪的16株DEC中有9株多重耐药菌，占56.25%；
分离自哺乳仔猪的10株DEC中有6株多重耐药菌，占60.00%；
分离自断奶仔猪的13株DEC中有11株多重耐药菌，占84.62%；
47株DEC菌株中检出产ESBLs菌株3株，均为EAEC型。
大肠埃希菌病在养殖业常见且多发，在养猪场可引起猪肠道相关的传染性疾病，如仔猪黄白痢和水肿病，具有高发病率和低治愈率的特点，所以死亡率较高，大肠埃希菌病是导致养猪场遭受巨大经济损失的重要原因之一[5]。猪肉在我国居民饮食结构中一直占据主要地位，在肉类产品消费中的比重高达60%以上，也是DEC污染的高危肉产品，对DEC进行合理的监控，能减少DEC通过食物链传播给人类，也对保障食品卫生安全有重大意义[6]。
表5 不同来源大肠埃希菌对17种抗菌药物敏感性结果
本试验对129株猪源大肠埃希菌进行系统进化分群研究，结果显示129株菌株分别属于A群(43.41%，56/129)，B1群(51.94%，67/129)，B2群(0.78%，1/129)，D群(3.86%，5/129)，其中优势群为B1群。有研究表明，大肠埃希菌的致病力与系统进化分群相关[7]，群A和B1为条件致病群，因毒力较弱直接引起宿主患病的概率较低，但在宿主免疫力降低时则会发挥致病性，群B2和D为可携带较多毒力因子且与致病性紧密相关的致病群[8]，引起肠道感染的大都为A、B1和D群，引起肠外感染的分布于B2和D群，本试验分离的大肠埃希菌条件致病群所占比例最大(95.35%，123/129)，这与韩一啸等报道的吉林省长春市猪源大肠埃希氏菌系统进化分群检测结果[9]一致，本试验中，检测出的大部分毒力基因均在A和B1群，有研究表明，虽然大多数共生大肠埃希菌来自A和B1群，但致泻性大肠埃希菌变异主要发生在A、B1和D群中，相关的毒力因子可以通过水平转移进入其他谱系，从而将受体菌株转化为潜在病原体[7]，试验结果表明，分离自哺乳仔猪的大肠埃希菌，系统进化分群更为复杂，应引起注意。
致泻大肠埃希菌的致病性是由它所携带的毒力因子所导致的，本试验纳入的分离菌株共检测到4种致病力相关的毒力基因，其中编码集聚热稳定性毒素A的基因astA与多次食源性EAEC暴发相关，在此次检测中分离率最高[10]；
编码猪源热稳定性肠毒素基因stp介导大肠埃希菌小肠定植及黏膜黏附过程，导致肠细胞电解质和水转运严重功能障碍，与ETEC的典型感染症状有关，仅断奶仔猪源中的1株大肠埃希菌检测到stp基因[11]；
表达志贺毒素基因Ⅱ(stx2e)的E.coli被称为EHEC，是导致仔猪水肿病的病原菌，也是重要的食源性人畜共患病病原，可通过污染饮食引发大规模食源性食物中毒，本研究妊娠母猪源分离菌有携带stx2的菌株检出[12-13]；
EPEC为携带有蛋白分泌物调节基因escV的大肠埃希菌，可附着于肠绒毛顶端上皮细胞，并引起病变，缺乏stx和eae基因的escV阳性菌株被归类为非典型EPEC，常经由生猪等动物制品传播，导致人类感染[1，14-16]，本研究在仔猪来源的菌株中检测到escV，并且在断奶仔猪来源的菌株中检测到1株同时携带astA-escV基因，为EAEC-EPEC杂交型菌株。对毒力因子的检测结果提示肉类来源致病菌造成人类感染的潜在风险，应加以重视。
本试验中养猪场DEC的阳性检出率为36.43%，略高于上海市和海南省规模化养猪场DEC阳性检出率(24.2%和21.28%)[17-18]，表明该养猪场应重视养殖场内环境卫生，即时合理地处理排泄物，同时强化猪场消毒的频次和方法，切断DEC的传播途径，降低DEC的检出率。本试验发现，断奶仔猪时期DEC污染率高于哺乳仔猪时期，与Wu等研究报道的断奶仔猪的粪便中大肠菌群紊乱可能反映了对各种肠道疾病敏感性增加的结论[19]相一致，由于断奶仔猪的肠壁结构不健全，生理功能也不完全，而断奶后母源抗体被切断，同时仔猪无法适应饮食结构的改变，导致免疫力降低，更易感染致病菌，提示应更加关注断奶仔猪养殖过程中DEC的感染。另外从仔猪和母猪来源分离出的DEC存在差异，仔猪中DEC阳性菌株的比例略高于母猪，而且仔猪中出现的毒力基因的多样性也高于母猪中检测到的毒力基因，与Bok等研究报道的结果[20]一致，研究结果表明，来自仔猪的菌株，构成了一个相当大的毒力基因库，可能增加肠外感染的潜在风险，并随着宿主生物的进化，共生大肠杆菌的遗传结构发生了一些变化[21]。
DEC可引起猪肠道传染性疾病，严重时可导致死亡，因此了解养殖场分离的大肠埃希菌的耐药情况尤为重要。本试验中分离自断奶仔猪的13株DEC中有11株多重耐药菌，占84.62%，其他3种来源的DEC中多重耐药菌也超过50%，DEC多重耐药情况严重，不同来源大肠埃希菌对17种抗生素耐药表型情况基本相同，提示一些固有型耐药抗生素不建议作为治疗药物，本结果中亚胺培南和美罗培南耐药率较低，与朱德永等的报道[22]一致，碳青霉烯类、酶抑制剂复合抗菌药物是治疗大肠埃希菌病最有效的抗生素。本结果还显示黏菌素耐药性较低，但因2017年黏菌素禁用政策的发布和其药物毒性较大，并不是作为治疗药物的最佳选择。根据药敏结果提示在治疗DEC时抗菌药物的选择应以药敏试验为科学依据，不应盲目用药，采取合理的针对性治疗药物，防止超级耐药菌出现。
养猪场环境是人畜共患病原菌的生存与繁殖的天然储存库，DEC可能通过粪便排出，造成环境、水和食物的污染来进行传播，另外可能在屠宰过程中错误的运输方式和不当的储存条件也会增加DEC污染的风险。在猪肉生产中，尤其是在养殖阶段，仔猪特别是断奶仔猪是猪场DEC防控的关键点，分阶段管理、提高饲养水平、及时并合理处理粪便从源头切断传播途径，对于保障居民食品卫生安全和防控食源性疾病流行有重大意义。
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