赵贵军，谌颖莲，曾德军，竭 航，张承露，吴佳勇，封孝兰
(1. 重庆市药物种植研究所，重庆 南川 408435；
2. 重庆金佛山森林生态系统野外科学观测研究站，重庆 南川 408435)
【研究意义】麝香是名贵的动物中药材，对于治疗心脑血管等疾病具有较好的疗效[1-2]，但目前麝香的生物合成机制尚不明确，产量较低，价格昂贵，极大地限制了麝香的临床应用，因此解析麝香的生物合成机制对于麝香生产效能的提高具有重要意义。【前人研究进展】麝鼠香与天然麝香的主要成分相似，是麝香较好的替代品，麝鼠也成为研究麝香生物合成机制的理想动物模型，利用组学测序分析麝鼠香生物合成过程中产生的中间分子是解析麝鼠香生物合成机制的重要手段[3-6]。麝香酮是麝香的主要药用和香用化学成分，学名3-甲基环十五烷酮，分子式为C16H30O，麝香中麝香酮含量大于2%[7-8]。前人研究表明，麝香中含有大量的长链脂肪酸、固醇类物质，提示含有C16的长链脂肪酸可能是麝香生物合成过程中产生的次生物质[9-12]。麝鼠香与天然麝香含有相同的麝香酮、降麝香酮烷酮等主要成分，可以用做天然麝香的替代品[2-3]，而麝香酮和降麝香酮含有相同的环碳链结构，提示环碳链分子结构的形成对于麝香和麝鼠香的生物合成具有较大的关联性。【本研究切入点】研究通过原代培养分离繁殖期的麝鼠香腺上皮细胞，并用外源雄性激素进行诱导[13-16]，以体香腺和肝脏组织为对照，利用代谢组学测序的方法分析次生碳链分子成分，探明环碳分子架构的生物合成过程，为进一步解析麝香的生物合成机制提供关键信息。【拟解决的关键问题】分析麝鼠香次生碳链分子成分和环碳分子架构的生物合成过程，为解析麝香的生物合成机理提供基础数据，也为麝香的生物体外合成研究奠定基础。
1.1 试验材料和试剂
9只12～18月龄繁殖期雄性麝鼠(5—6月)，由重庆市药物种植研究所动物中心饲养繁育。将麝鼠处死后迅速采集麝鼠香腺和肝脏组织，送至北京诺禾致源生物科技有限公司采用GC-MS进行非靶标代谢组学测序。
胎牛血清(北京沃卡威生物技术公司)、100×青霉素—链霉素双抗(上海生工生物技术有限公司)、PBS(北京索莱宝科技有限公司)、胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)、DMEM高糖培养基(北京沃卡威生物技术公司)、丙酸睾酮(华中药业股份有限公司)。
1.2 试验方法
1.2.1 麝鼠香腺上皮细胞原代培养 将麝鼠处死后迅速采集麝鼠香腺组织，置于无菌操作台下使用PBS冲洗后取香囊顶端的香腺剥离剪碎，放入含10%胎牛血清DMEM培养基的25 cm2细胞培养瓶，置于37 ℃、含5%CO2的培养箱中培养，待组织块培养2～3 d后，组织块四周出现单层细胞层，再使用胰酶消化后传代接种，分为诱导组和对照组，每组3个重复，待生长汇聚到约50%后，诱导组替换5 mL含有1 mg/mL的丙酸睾酮(Testosterone Propionate，TP)完全培养基，对照组替换无睾酮完全培养基5 mL，培养48 h后收集细胞代谢物，送至北京诺禾致源生物科技有限公司采用GC-MS进行非靶标代谢组学测序。
1.2.2 代谢组学测序分析 样品委托北京诺禾致源生物科技有限公司进行非靶标代谢组学测序和结果注释，注释使用高分辨率二级图谱数据库mzCloud、mzVault及MassList一级数据库进行分子特征峰匹配鉴定，根据设置的ppm、信噪比(Signal-to-Noise ratio，S/N)、加合离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量分析。通过代谢物表达情况的PCA降维分析，对样本进行质控鉴定；
使用KEGG数据库(www.genome.jp/kegg/pathway)对代谢通路进行注释，并通过抽样概率对通路进行富集分析，使用R 4.0软件进行统计分析，利用ggplot2和pheatmap语言包绘制火山图和热图(github.com/YLCHEN1992/cstatplot)，使用GraphPad Prism 9.0绘制柱状图。
2.1 样本的PCA降维分析
降维后变异方差来源分别为PC1和PC2，累计方差值越高代表性越强，以PC1和PC2降维数值为参考，将样品投射到二维平面，根据样品的聚集情况判断样品之间的特征一致性和类型，结果显示(图1)，离体培养的香腺上皮细胞、香腺组织与肝脏组织能被明显区分(变异方差来源累计86.381%)，在离体培养的香腺上皮细胞中，TP诱导组和对照组差异不明显；
进一步对离体培养细胞使用共有差异代谢物表达进行降维分析，结果显示诱导组与对照组能够明显区分开(方差变异来源累计97.133%)。
A. 全部测序样本的PCA降维分析;B. 离体培养诱导组与对照组的PCA降维分析
2.2 香腺上皮细胞TP诱导模型差异代谢物分析
通过麝鼠香腺上皮细胞离体培养，在TP诱导组细胞培养液中能够检测出大量雄性激素类似物高表达，如睾酮、睾酮β-D-葡糖苷酸、甲羟孕酮、前列腺素等；
同时诱导组出现甲氧麻黄酮、犬尿酸、N-乙酰-L-谷氨酸和黄曲霉素G1类分子的低表达。根据x轴的表达变化Fold Change系数与转换P值，由图2可以看出，与对照组相比，诱导组在neg、pos数据库中分别有19、28个代谢分子合成上调，总共有4个代谢分子合成下调，各样品组均未检测到降麝香酮(环十五烷烯酮)存在。
A.neg数据库注释；
B.pos数据库注释
通过合并neg和pos数据库注释的合成差异代谢分子，进一步筛选具有完全匹配峰的代谢分子33个，其中有31个代谢分子在诱导组样品中呈现高表达，2个代谢分子呈现低表达；
高表达代谢分子主要为长链脂肪酸、固醇、芳香族和甾酮类衍生物，如18碳和20碳长链饱和脂肪酸、羟基睾酮、雄烯二酮等，低表达分子为色氨酸分解产物犬尿酸和精氨酸中间体N-乙酰-L-谷氨酸(图3)。
图3 麝鼠香腺上皮细胞离体培养TP诱导组与对照组代谢物差异表达
2.3 香腺上皮细胞TP诱导模型差异代谢物的KEGG通路富集分析
对pos数据库高度匹配的差异代谢组分进行KEGG通路富集分析(图4)，TP诱导离体香腺上皮细胞后，差异代谢组分显著富集在内分泌阻抑(map01522)和类固醇激素生物合成(map00140)通路上，同时包含卵巢类固醇合成和部分癌相关代谢通路，其中内分泌阻抑主要为睾酮和雄烯二酮介导的卵巢雌激素类物质合成阻抑，类固醇激素的合成主要包括雄性激素的生物合成及前列腺素、皮质醇等，其他代谢通路抽样统计不显著。其中色氨酸代谢途径(map00380)涉及犬尿酸分子，2-氧代羧酸代谢(map01210)、精氨酸生物合成通路(map00220)和氨基酸生物合成通路(map01230)涉及N-乙酰-L-谷氨酸分子，花生四烯酸代谢(map00590)和5-羟色胺突出信号通路(map04726)涉及前列腺素分子，催乳素信号通路(map04917)涉及雄酮激素。
数字表示代谢物匹配的分子数目;颜色表示P值大小
2.4 麝鼠肝脏组织与香腺组织差异代谢物分析
代谢组学检测繁殖期麝鼠肝脏和香腺组织代谢物含量情况，结果显示，香腺组织相较于肝脏组织在neg、pos数据库中分别有24、44个代谢分子合成上调，有109、145个代谢分子合成下调(图5)；
峰度完全匹配且在香腺组织中高表达的代谢物有肌苷、麦芽醇、乙酰-L-肉碱、L-苏氨酸、DL-谷氨酰胺、10-羟基癸酸、4-硝基苯酚和水杨酸，碳链分子最多、最少分别有10、4个碳原子(表1)。
表1 高匹配度差异表达代谢物在香腺和肝脏组织中的相对含量
A.neg数据库注释；
B.POS数据库注释
麝鼠香的主要成分为降麝香酮，属于环十五烷烯酮，分子式为C15H26O，较麝香酮(3-甲基环十五烷烯酮，分子式为C16H28O)缺少1个甲基基团，它们具有相同的环状碳链结构，而环状碳链结构的形成是解析麝香生物合成的关键部分[4,9,17]。首先碳链的构成需要碳源，主要涉及双碳原子的逐步添加，如丙酮酸(可由氨基酸转换的碳源)，同时涉及乙酰辅酶A、乙酰肉碱、脂肪酸合酶转移亚基等分子参与。为确保样品分类和测序的准确性，将各样品的代谢组学测序结果进行降维分析，结果显示离体培养香腺上皮细胞、香腺和肝脏组织能够明显分开，提示测序结果有一定的准确性和可信度。麝香及麝鼠香产物的代谢测序发现，其中含有大量的脂肪酸类、雄激素和前列腺素类衍生物等[1,11]，这些物质与降麝香酮碳链的生成具有较大关联性。使用丙酸睾酮(TP)诱导麝鼠香腺上皮细胞后，主要表现出氨基酸、脂肪酸、前列腺素和雄性激素的代谢变化，色氨酸在动物体内涉及烟酸和5-羟色胺的形成，影响机体的代谢速度和神经系统；
犬尿酸是色氨酸分解代谢产物[18]，同时涉及神经系统的调节，犬尿酸含量减少提示细胞中以犬尿酸途径的色氨酸分解代谢减弱；
N-乙酰-L-谷氨酸是谷氨酸到鸟氨酸和精氨酸合成的重要中间产物[19]，鸟氨酸可进入精氨酸合成循环系统，促进精氨酸的生物合成，谷氨酸在转变为鸟氨酸的途径中形成N-乙酰-L-谷氨酸，N-乙酰-L-谷氨酸含量减少提示TP诱导后细胞精氨酸或鸟氨酸的合成受限；
色氨酸和精氨酸代谢的变化，提示了麝鼠降麝香酮生物合成的新途径，可为解析降麝香酮的生物合成研究提供新的方向和参考，但需要通过对麝鼠注射通路激活剂或抑制剂等试验来验证，同时也提示色氨酸和精氨酸在降麝香酮合成过程中可能具有重要作用，如为脂肪酸链合成提供碳源。长链脂肪酸碳链长度多样，TP诱导细胞后出现多种长链脂肪酸的累积，比如C18/20的长链脂肪酸累积，进一步证明了长链脂肪酸在降麝香酮生物合成过程中的重要作用，而花生四烯酸、雄酮、雄烯二酮、前列腺素合睾酮出现累积，这可能是诱导剂TP培养基中的代谢产物或诱导细胞后生物自身代谢分泌的产物[9,20]；
前列腺素和雄性激素有很大的可能是激素诱导正常动物性征信号通路，这些通路不排除是属于麝香或麝鼠香生物合成的共有通路[21]，结果进一步提示色氨酸和精氨酸的代谢变化可能是为长链脂肪酸或性激素的合成提供碳源骨架。
结合KEGG通路富集分析结果，发现麝鼠香腺上皮细胞离体培养使用TP诱导后，其色氨酸和精氨酸的通路代谢发生显著变化，同时长链脂肪酸的合成增多，提示了其在麝香酮或降麝香酮合成过程中的重要性，色氨酸、精氨酸和长链脂肪酸代谢通路可作为挖掘麝香和麝鼠香生物合成机制研究新方向，还需要进一步试验探索。长链脂肪酸类代谢分子与麝香酮或降麝香酮的碳骨架相似，长链脂肪酸末尾的羧基和在内部的烯键对其成环具有很大的潜能，而肝脏是有机物代谢较为旺盛的脏器[22-23]，通过香腺和肝脏组织之间的差异代谢物分析繁殖期麝鼠香腺和肝脏中脂肪酸代谢的差异，找出香腺的特征代谢产物及脂肪酸代谢差异分子，结果显示香腺组织的肌苷含量显著高于肝脏，且含有大量的乙酰肉碱，高含量的肌苷提示香腺组织有较快的代谢速率[24]，乙酰肉碱是运输脂肪酸的载体[25]，说明繁殖期麝鼠香腺比肝脏具有更快的脂肪代谢速率，提示脂肪酸运载加强为降麝香酮的生物合成提供物质基础。相较于肝脏组织，香腺表现出明显的苏氨酸[26]、麦芽醇等代谢分子含量的升高，苏氨酸和麦芽醇等具有作为降麝香酮生物合成过程中重要的前体物质，为降麝香酮的生物合成研究提供参考数据。
在离体培养的麝鼠香腺细胞中，睾酮诱导能够影响色氨酸、精氨酸和长链脂肪酸代谢通路，揭示其在降麝香酮合成过程中的重要性，因此色氨酸、精氨酸和长链脂肪酸代谢通路可作为挖掘麝香和麝鼠香生物合成机制的研究新方向。繁殖期麝鼠香腺组织比肝脏含有更多的肌苷、乙酰肉碱、苏氨酸等代谢物，本研究结果为降麝香酮的生物合成机制研究提供参考数据。
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