徐英黔，邢可心，邱 咸，周 瑶，刘佳佳，胡君一
（1.辽宁科技大学 化学工程学院，辽宁 鞍山 114051；
2.浙江华才检测技术有限公司，浙江 绍兴 311800）
珍珠是由沙子等外来异物刺激蚌的外套膜，从而产生大量的珍珠质，把沙子等异物逐层包裹起来形成的［1］。近年来，因珍珠的功效被逐渐发掘，珍珠的加工方法也日渐成熟。珍珠在化妆品中一般是加工成珍珠粉，应用在粉底、粉饼类彩妆化妆品中；
或者加工成珍珠粉水解液，应用在护肤类产品中［2-3］。有研究表明，珍珠粉水解液中含有18种氨基酸、28种微量元素［4］以及牛磺酸、叶琳体等物质［5］，具有抗疲劳、抗衰老、美白等功效［6］。珍珠粉水解液分子量小，相比于珍珠粉直接应用在化妆品中，更有利于人体皮肤的吸收。
珍珠粉水解液的制备有三种方式：用酸进行水解、用单一/复合酶进行酶解或者采用酸-酶联用进行水解［7-9］。酸水解一般使用乳酸、盐酸等，但水解液中氨基态氮含量很低；
酸-酶水解方法的水解液中氨基酸含量高，但是制备方式复杂；
酶解方法的条件更加温和、高效，操作步骤也更简便，有利于工业化生产。
本文将胰蛋白酶和木瓜蛋白酶两种酶进行复合，对微米级珍珠粉进行水解制备珍珠粉水解液，以氨基态氮含量为评价标准，通过单因素及响应面实验，优化复合酶水解珍珠粉工艺的最佳条件，并对珍珠粉水解液的皮肤渗透性进行评价。
1.1 材料与仪器
珍珠粉，山东冠特生物工程有限公司；
1.1-二苯基-2-苦肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），西亚化学科技有限公司；
茚三酮，山东穗华生物科技有限公司；
无水乙醇，分析纯，广州东业化工；
磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钾，均为分析纯，国药化学试剂有限公司；
木瓜蛋白酶的酶活力100 000 U/g、胰蛋白酶的酶活力100 000 U/g，北京鸿润宝顺科技有限公司。
Lambda 750 S紫外分光光度计，Perkin Elmer；
OSB-2100油浴锅，上海爱朗仪器有限公司；
80-2离心机，常州天瑞仪器有限公司；
XQG-2000电热鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；
HDT 1000立式扩散池系统，月旭科技股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 珍珠水解液制备工艺流程 称取珍珠粉3.0 g，放入锥形瓶中，加30 mL去离子水振荡溶解。加入适量复合酶，调节至酶的适宜温度及pH值，加热180 min。反应结束，将其取出，置于95℃热水浴中，加热15 min。室温放置至40℃，以3 800 r/min离心15 min。取上清液，测定氨基态的氮含量。
1.2.2 氨基态氮含量的测定 将1 mL标准氨基酸溶液分别稀释至20、40、60、80、100 μg/mL。分别加入1 mL去离子水，充分混匀，再加入1 mL 20 mg/L茚三酮溶液，充分摇匀后，90℃水浴加热15 min，取出后立即降至室温。再加入7 mL 75%乙醇稀释。在570 nm处测其吸光值，绘制氨基态氮含量的标准曲线。不同条件下，珍珠粉水解液的水解程度用氨基态氮含量表示［10］。样品中氨基态氮含量测定方法与绘制标准曲线的实验方法相同。样品液中的氨基态氮含量可以通过标准曲线计算。
1.2.3 复合酶比例的选择 在酶解温度40℃、pH=7.0、复合酶添加质量分数为1.8%、酶解时间180 min条件下，将胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按不同质量比配成复合酶，考察胰蛋白酶与木瓜蛋白酶两者比例对氨基态氮含量的影响。
1.2.4 单因素实验 在酶解温度为40℃、pH=7.0、酶解时间180 min、复合酶质量比为1∶3等相同条件下，考察复合酶添加量对氨基态氮含量的影响。
在酶解温度40℃、复合酶质量比为1∶3、复合酶添加质量分数为1.8%、酶解时间180 min等相同条件下，考察pH值对氨基态氮含量的影响。
在酶解温度40℃、pH=7.0、复合酶质量比为1∶3、复合酶添加质量分数为1.8%等相同条件下，设置不同酶解时间，考察酶解时间对氨基态氮含量的影响。
在pH=7.0、复合酶质量比为1∶3、复合酶添加质量分数为1.8%、酶解时间180 min等相同条件下，分别设置不同的酶解温度，考察酶解温度对氨基态氮含量的影响。
1.2.5 响应面优化酶解工艺 在单因素实验的基础上，以复合酶添加量、pH值、酶解时间以及酶解温度为变量，以氨基态氮含量为响应值，设计四因素三水平的响应面试验。实验因素及水平详见表1。
表1 响应面分析因素水平Tab.1 Response surface analysis for factor levels
1.2.6 DPPH清除率的测定 取1 mL珍珠粉水解液（或对照品1 mg/L抗坏血酸）加入到3 mL 26 μg/mL DPPH无水乙醇溶液中，室温下，将溶液避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度A0；
用无水乙醇代替DPPH溶液，测定吸光度为A1。DPPH的清除率计算式［11］
1.2.7 皮肤渗透性实验 将去除皮下组织的新鲜猪皮洗净，剪成边长2.5 cm的正方形［12］。将角质层朝上放置在立式扩散池的进样池与接受池之间。在接受池中加满磷酸缓冲盐溶液（PBS）（pH=7.4），加入磁子。向进样池中加入1 mL水解样品，使其均匀完全覆盖住皮肤。设置实验温度为32℃，400 r/min搅拌下作用24 h。反应结束后，517 nm处测定其吸光值，利用接受池中氨基态氮含量计算皮肤渗透性［13］。
每个实验重复三次，取平均值。
2.1 氨基态氮含量标准曲线
绘制的氨基态氮含量标准曲线如图1所示。氨基态氮含量标准方程为：y=0.025 1x-0.067，R2=0.996 9。在0~100 g/mL范围内，氨基态氮含量与吸光度成线性关系。
图1 氨基态氮含量标准曲线Fig.1 Standard curve of amino nitrogen content
2.2 复合酶比例的确定
在酶解温度40℃、pH=7.0、复合酶添加量为1.8%、酶解时间180 min条件下，分别将胰蛋白酶与木瓜蛋白酶按1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的质量比进行酶解，得到水解液中氨基态氮含量，结果如图2所示。随着胰蛋白酶用量的增多，氨基态氮含量先升高后降低。胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3时，氨基态氮含量达到4.87 μg/ml，处于最大值。胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3为复合酶的最佳比例。
图2 复合酶比例对氨基态氮含量影响Fig.2 Effect of compound enzyme proportion on amino nitrogen content
2.3 单因素实验
2.3.1 复合酶添加量对反应的影响 在其他条件都不变的情况下，改变复合酶添加质量分数分别为0.6%、1.2%、1.8%、2.4%、3.0%，实验结果如图3所示。氨基态氮含量随着复合酶添加量的增加而增加。在复合酶添加量为1.8%时，达到最大值，之后氨基态氮含量基本保持稳定。这说明在底物浓度一定时，适当增加复合酶的用量，酶解效率可以提高，最适宜的复合酶添加量为1.8%。
图3 复合酶添加量对氨基态氮含量影响Fig.3 Effect of enzyme addition on amino nitrogen content
2.3.2 pH值对反应的影响 pH值对酶的活性影响比较大，酶的空间构型随pH值变化也发生改变。pH值过高或过低都会影响酶与底物的正常结合，从而抑制酶解反应。在pH=5、6、7、8时，实验结果如图4所示。随着pH值增大，氨基态氮含量先升高再降低。当pH=7时，氨基态氮含量出现最大值，说明此时水解程度最高。
图4 pH值对氨基态氮含量影响Fig.4 Effect of pH value on amino nitrogen content
2.3.3 酶解时间对反应的影响 其他条件不变，酶解时间分别为60、120、180、240、300、360 min时，实验结果如图5所示。酶解时间在180 min以内，随着酶解时间的增加，氨基态氮含量显著增大。但在180 min后，氨基态氮含量基本稳定，说明此时已经接近完全水解，氨基态氮处于饱和状态，故最佳的酶解时间为180 min。
图5 酶解时间对氨基态氮含量影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on amino nitrogen content
2.3.4 酶解温度对反应的影响 只改变酶解温度为30、40、50、60℃，其他条件不变时，实验结果如图6所示。随着温度升高，氨基态氮含量先升高后降低，40℃时，氨基态氮含量达到最大值。因为在30℃时，由于环境温度过低，影响酶的活性，因此反应速率降低；
超过40℃后，部分酶会因温度过高而失去活性，从而影响该反应酶解程度。
图6 酶解温度对氨基态氮含量影响Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on amino nitrogen content
2.4 酶解珍珠粉响应面优化
2.4.1 实验设计与结果分析 根据前期实验结果，选取A（复合酶添加量）、B（pH值）、C（酶解时间）、D（酶解温度）为四因素，各取三个水平，以氨基态氮含量作为响应值，进行响应面分析，对本实验工艺进行优化，实验结果如表2所示。
表2 响应面分析因素结果Tab.2 Response surface analysis factor results
利用Design-Expert 10.0软件进行Box-Behnken模型设计及数据的统计学分析，得到回归方程
回归方程及各项方差分析如表3所示。回归模型的P（＜0.000 1）＜0.05，说明模型达到显著水平；
失拟项P=0.056 0＞0.05，模型失拟不显著，说明在所选各因素的水平值内，用此模型对实验结果进行分析和预测是准确的。观察各因素的P值，一次项A（复合酶添加量）、B（pH值）、C（酶解时间）、交叉项AD及二次项A2、B2、C2、D2对模型呈现极显著性影响（P＜0.01），一次项D（酶解温度）、交叉项AC对模型有著影响（P＜0.05）。
表3 氨基态氮含量响应面结果Tab.3 Response surface results of amino nitrogen content
2.4.2 各因素及交互作用对氨基态氮含量的影响 根据F值推断四个因素对响应值影响大小为：复合酶添加量＞pH值＞酶解时间＞酶解温度。
以氨基态氮含量为响应值，根据回归方程分析四因素之间各交互作用对氨基态氮含量的影响［14］，结果如图7所示。随着复合酶添加量以及pH值不断增加，氨基态氮含量先升高后降低，两因素有交互作用，其中复合酶添加量对氨基态氮含量的影响更加明显。在酶解时间一定时，氨基态氮含量随着复合酶添加量的增加先增大后趋于不变，酶解时间对氨基态氮含量的影响略小于复合酶的添加量。复合酶添加量不变，酶解温度升高，氨基态氮含量先增加后降低，酶解温度对氨基态氮含量的影响要小于复合酶添加量。在酶解时间一定时，氨基态氮含量随着pH值的增大先增大后减小，酶解时间和pH值的等高线图接近于圆形，说明这两个因素的交互作用对于氨基态氮含量的影响较小。在pH值一定时，氨基态氮含量随着温度的升高先增大后减小，温度对氨基态氮含量的影响没有pH值显著。酶解温度对氨基态氮含量的影响远没有酶解时间的影响大。响应面结果分析与方差分析一致，证明该模型可靠。
图7 四因素交互作用对氨基态氮含量影响的响应面和等高线Fig.7 Response surfaces and contours of effects of four factor interaction on amino nitrogen content
续图7四因素交互作用对氨基态氮含量影响的响应面和等高线Fig.7 Response surfaces and contours of effects of four factor interaction on amino nitrogen content
根据二次回归方程利用Design-Expert 10.0软件作进一步分析得出，氨基态氮含量最高时对应的条件为：复合酶添加质量分数为2.1%，pH=7.0，酶解时间为202 min，温度为44℃。在此条件下，氨基态氮含量预测结果为5.00 μg/mL。
2.4.3 最佳酶解方案验证 根据软件的预测方案，结合实际的可操作性，取酶添加量为2.0%，pH=7.0，酶 解 时 间 为200 min，温 度 为44℃，进行三次平行实验，得到氨基态氮含量平均值为4.98 μg/mL，与模型预测的结果相近，说明该响应面模型对于优化酶解珍珠粉工艺有效且可行。
2.4.4 DPPH抑制率测定 以1 mg/L的抗坏血酸溶液作为对照，分别测定抗坏血酸与酶解液在517 nm处吸光度，计算出酶解液的DPPH抑制率为40.6%。沈喆鸾采用常规固液提取法提取珍珠粉，得到的提取物对DPPH的清除率几乎为0［15］。由此可知，采用复合酶酶解珍珠粉对DPPH的抑制率能显著提高。
2.4.5 皮肤渗透性实验 样品中氨基态氮含量为4.98 μg/mL，通过测定517 nm处吸光度及氨基态氮含量标准曲线，计算出接收池中氨基态氮含量为4.12 μg/mL，渗透率达到82.7%，远高于通过常规固液提取的珍珠粉。表明酶解后的珍珠粉，分子量更小，更利于皮肤的吸收。
采用复合酶同步酶解的实验方法，采用单因素及响应面优化酶解制备珍珠粉水解液工艺。通过响应面实验，得到复合酶酶解珍珠粉的最佳条件为复合酶中胰蛋白酶∶木瓜蛋白酶=1∶3，复合酶添加质量分数为2.0%，pH=7.0，酶解时间200 min，温度为44℃，氨基态氮含量达到4.98 μg/mL。酶解液的DPPH抑制率为40.6%，酶解液对皮肤的渗透率达到82.7%，为珍珠粉酶解液在化妆品中应用提供参考。
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