李文涛，王韵涵，刘江月
（潍坊医学院病理生理教研室，山东潍坊261053）
糖尿病大血管并发症是糖尿病患者致死致残的首要原因［1］，高糖诱导的氧化应激引起血管内皮细胞损伤是2型糖尿病大血管并发症的始动环节。尽管人们早已认识到氧化应激是糖尿病并发症的核心发病机制，但单纯的抗氧化治疗预防大血管并发症的效果并不理想。有研究表明，自噬在神经退行性疾病、肿瘤、肝脏疾病、心脏病、代谢综合征、衰老和炎症中发挥着作用［2］，自噬的发现为防治糖尿病大血管并发症提供了新的思路。近几年自噬与糖尿病及其慢性并发症的关系引发广泛关注。自噬是细胞适应不利环境，维持稳态的重要途径。高糖诱导的活性氧（reactive oxygen species，ROS）损伤血管内皮细胞后，DNA损伤启动了修复系统，其修复的程度决定了细胞的命运［3］。由此可以看出自噬在血管内皮损伤修复中的重要性，自噬的增强促进了修复，这也使其成为潜在的促进细胞损伤修复的新靶点。目前，如何调节细胞自噬逐渐成为研究热点。梓醇是地黄中发挥药理作用的主要活性成分之一，具有抗氧化应激、抗炎等多种药理学作用。前期研究发现梓醇梓醇（catalpol，CAT）能够减轻糖尿病大血管损伤［4-5］，那么，梓醇是否通过促进自噬，减轻高糖诱导血管内皮DNA损伤，从而减轻大血管损伤呢？因此，本实验的目的就是明确梓醇减轻高糖诱导血管内皮DNA损伤的作用，并以自噬在为切入点，研究其可能的作用机制，为临床防治糖尿病大血管病变提供新思路，为寻找新药提供新靶点。
1 材料与仪器
1.1 细胞株人脐静脉内皮细胞株EA.hy926购自中国科学院细胞库。
1.2 药物与试剂梓醇（纯度≥98%）购自成都植标化纯生物科技有限公司；
自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）购自Sigma；
8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；
ROS及DNA损伤检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；
磷酸化组蛋白H2AX变异体（γH2AX）抗体购自Abcam；
beclin-1、p62和LC3抗体及Ⅱ抗购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 主要仪器DYCN-25D型电泳仪（北京市六一仪器厂）；
激光共聚焦显微镜（Olympus）；
752型紫外分光光度计（上海精密仪器有限公司）；
转膜仪、凝胶成像分析仪（BIO-RAD）。
2 方法
2.1 实验分组及干预方法生长良好的EA.hy926细胞，随机分为空白对照（control，CON）组、高糖（high glucose，HG）组、梓醇高剂量（HG+CAT-H）组、梓醇低剂量（HG+CAT-L）组和自噬抑制剂（HG+CAT-H+3-MA）组。HG+CAT-H、HG+CAT-L和HG+CAT-H+3-MA组分别加入0.5、0.05及0.5 mmol/L浓度的梓醇孵育24 h，HG+CAT+3-MA组继续加入5 mmol/L浓度3-MA共孵育24 h后弃培养液；
HG、HG+CAT-H、HG+CAT-L和HG+CAT-H+3-MA组再加入终浓度33 mmol/L的葡萄糖培养24 h，进行后续实验。根据文献［6-9］确定高糖、梓醇及3-MA的剂量并建立了高糖诱导EA.hy926细胞DNA损伤模型。
2.2 流式细胞术检测ROS生成收集处理后的各组细胞，PBS溶液洗涤，离心5 min，弃上清，加入稀释的ROS荧光探针染剂400 μL吹打重悬，37℃孵育30 min，间隔5 min吹打1次，孵育后立即采用流式细胞术检测ROS。
2.3 ELISA检测8-OHdG水平收集处理后的各组培养液上清，按照ELISA试剂盒说明书操作，测定8-OHdG水平。
2.4 激光共聚焦检测γH2AX水平处理后的各组细胞去上清，加入4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗涤3次，Triton-X透化细胞30 min，胎牛血清封闭1 h，加入Ⅰ抗（1∶200）4℃过夜，荧光标记Ⅱ抗避光孵育1 h，DAPI细胞核染色10 min，激光共聚焦显微镜观察拍照并进行荧光强度定量分析。
2.5 Western blot检测γH2AX、beclin-1、p62和LC3-II/LC3-I蛋白表达收集细胞提取总蛋白，所有蛋白SDS-PAGE分离后转膜，5%脱脂奶粉溶液封闭1 h后加Ⅰ抗（1∶500），4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入Ⅱ抗，37℃孵育1 h，TBST洗涤4次，ECL发光显色，凝胶成像系统扫描分析。
2.6 电镜观察自噬小体的形成情况收集处理后的各组细胞，用2.5%戊二醛4℃固定过夜。1%锇酸固定液固定2 h，脱水、渗透、包埋，超薄切片机切片70 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察自噬小体。
3 统计学处理
采用SPSS 18.0软件分析，计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间采用单因素方差分析，两组间采用SNK-q进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。
1 梓醇对高糖诱导EA.hy926细胞ROS生成及8-OHdG含量的影响
与CON组比较，HG组ROS生成及8-OHdG含量均显著增加（P＜0.05）；
与HG组比较，HG+CAT-H、HG+CAT-L组ROS生成及8-OHdG含量均显著降低（P＜0.05）；
与HG+CAT-H组比较，HG+CAT-H+3-MA组ROS生成及8-OHdG含量显著升高（P＜0.05），见图1。
2 梓醇对高糖诱导EA.hy926细胞γH2AX的影响
与CON组比较，HG组γH2AX生成均显著增加（P＜0.05）；
与HG组比较，HG+CAT-H、HG+CAT-L组γH2AX生成均显著减少（P＜0.05），与HG+CAT-H组比较，HG+CAT-H+3-MA组γH2AX生成显著增加（P＜0.05），见图2。
Figure 1.The effect of catalpol（CAT）on ROS generation and 8-OHdG content in high glucose（HG）-treated EA.hy926 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；
#P＜0.05 vs HG group；
△P＜0.05 vs HG+CAT-H group.图1梓醇对高糖诱导EA.hy926细胞ROS生成及细胞上清8-OHdG含量的影响
Figure 2.The effect of catalpol（CAT）on γH2AX in high glucose（HG）-treated EA.hy926 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；
#P＜0.05 vs HG group；
△P＜0.05 vs HG+CAT-H group.图2梓醇对高糖诱导EA.hy926细胞γH2AX的影响
3 梓醇对高糖诱导EA.hy926细胞γH2AX、beclin-1、p62和LC3-II/LC3-I蛋白表达的影响
与CON组比较，HG组γH2AX蛋白含量及p62蛋白表达均显著增加（P＜0.05），beclin-1、LC3-II/LC3-I蛋白表达则均显著减少（P＜0.05）；
与HG组比较，HG+CAT-H、HG+CAT-L组γH2AX蛋白含量及p62蛋白表达均显著减少（P＜0.05），beclin-1、LC3-II/LC3-I蛋白表达均显著增加（P＜0.05）；
与HG+CAT-H组比较，HG+CAT-H+3-MA组γH2AX蛋白含量及p62蛋白表达均显著增加，而beclin-1、LC3-II/LC3-I蛋白表达均显著减少（P＜0.05），见图3。
Figure 3.The effect of catalpol（CAT）on the expression of γH2AX，beclin-1，p62 and LC3-II/LC3-I proteins in high glucose（HG）-treated EA.hy926 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；
#P＜0.05 vs HG group；
△P＜0.05 vs HG+CAT-H group.图3梓醇对高糖诱导EA.hy926细胞γH2AX、beclin-1、p62和LC3-II/LC3-I蛋白表达的影响
4 梓醇对高糖诱导的EA.hy926细胞自噬小体形成的影响
与CON组比较，HG组自噬小体形成显著减少；
与HG组比较，HG+CAT-H、HG+CAT-L组自噬小体形成均显著增加（P＜0.05）；
与HG+CAT-H组比较，HG+CAT-H+3-MA组自噬小体形成显著减少（P＜0.05），见图4。
Figure 4.The effect of catalpol（CAT）on the formation of autophagosomes in high glucose（HG）-treated EA.hy926 cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；
#P＜0.05 vs HG group；
△P＜0.05 vs HG+CAT-H group.图4梓醇对高糖诱导的EA.hy926细胞自噬小体形成的影响
糖尿病的发病率在全球范围内逐年上升，而糖尿病患者最主要的威胁为慢性并发症［10］。T2DM的持续高血糖状态可导致心血管病变、视网膜病变、肾脏病变、神经病变等多种并发症。研究证实DNA损伤与糖尿病等代谢性疾病的发生密切相关［11］，糖尿病高糖状态所致的氧化应激是多种慢性并发症形成的关键原因之一，也是诱发DNA损伤的重要因素。氧化应激产生过多的活性氧作为一种突变诱导剂，可将DNA链上的鸟嘌呤氧化为8-羟基鸟嘌呤。在DNA复制过程中，8-OHdG易与腺嘌呤错配，导致G：C到T：A颠换突变，形成DNA损伤。ROS还会引起DNA双链断裂，有组蛋白H2AX迅速磷酸化，生成磷酸 化 的组蛋 白γH2AX。8-OHdG、γH2AX是 细 胞DNA损伤的特征性标志，通常用于判断细胞DNA损伤［12］。本研究以EA.hy926细胞为研究对象，高糖诱导建立细胞DNA损伤模型，证实ROS生产显著增多，同时发现8-OHdG含量及γH2AX表达均显著增多，说明高糖能够致EA.hy926细胞DNA损伤。多种植物化合物具有抗DNA损伤的作用，特别是可拮抗和预防自由基所造成的氧化性DNA损伤。运用DPPH自由基和·OH反应模型，发现芹黄素可对自由基产生淬灭效应，并对·OH所致的DNA损伤产生抑制作用［13］。羟基酪醇是一种橄揽叶提取物，可通过保护DNA损伤而抑制苏丹红一号的毒性作用［14］。还有研究证实姜黄素可以保护丙烯酰胺所致的HepG2细胞DNA损伤。梓醇作为地黄的主要活性成分，具有降低血糖、血脂、保护心血脑管系统等作用。本研究发现梓醇能够显著降低8-OHdG含量，减少γH2AX蛋白表达，减轻了高糖诱导的EA.hy926细胞DNA损伤，证实梓醇与很多植物化合物一样具有抗DNA损伤的作用。
细胞自噬是细胞内溶酶体吞噬降解衰老、受损蛋白质及细胞器的过程，有助于维持细胞内环境稳定，是一种细胞内的适应性保护机制。自噬能参与调控多种外源化学物诱导细胞毒性转归，与其参与调节多种损伤修复关键酶的表达而加速DNA损伤的修复进程、维持基因组稳定性密切相关。自噬和DNA修复是维持细胞正常状态的生物学过程，自噬可参与DNA损伤修复。自噬小体形成是自噬激活的特征，而beclin-1、p62和LC3是自噬相关基因，在自噬小体形成过程中起关键作用，其表达能反映自噬的激活程度。Tian等［15］的研究发现，高糖激活mTOR信号通路，抑制LC3-II/LC3-I、beclin-1的表达以及增加SQSTM1/p62堆积抑制自噬，从而促进链脲菌素诱导的糖尿病Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化。高血糖可导致内皮细胞内的ROS水平上升，从而导致炎症，内皮细胞的损伤，是糖尿病大血管病变的始发事件。Xie等［16］的研究中发现，AGEs可以使血管内皮细胞中的ROS水平升高，作为一种防御机制，机体内的自噬水平相应的增加，而自噬抑制剂3-MA加重了AGEs对内皮细胞的损伤。以上研究均表明自噬与糖尿病大血管病变密切相关，糖尿病时氧化应激导致机体自噬增加，然而长期高血糖又会抑制自噬导致内皮细胞损伤，大血管病变发生。本研究也发现，高糖组自噬小体形成显著减少，自噬相关蛋白beclin-1、LC3-II/LC3-I表达均显著减少，而p62蛋白表达显著增加，说明高糖确实抑制了细胞自噬。而梓醇预处理的EA.hy926细胞自噬小体形成显著增加，自噬相关蛋白beclin-1、LC3-II/LC3-I表达均显著增加，而p62蛋白表达显著减少，证实了梓醇能够促进自噬增加。
综上所述，本研究证实了梓醇能够有效地减轻高糖诱导的EA.hy926细胞DNA损伤，其机制可能与梓醇促进自噬增强有关。然而，在此次研究中尚有不足：第一，梓醇诱导自噬的机制还未阐明，在今后的研究中将通过各种分子生物学手段明确此问题；
第二，仍需要进一步动物实验支持此次研究的发现，以上两点将是下一步研究工作的重要内容。