范 宁，段雪红，杨 瑜，王媛媛，鱼丽萍，谢立民，王 苗
（咸阳市第一人民医院a.检验科；
b.神经内科，陕西咸阳 712000）
血流感染（blood stream infection，BSI）是一种严重的全身感染性疾病，发病率较高，可导致机体多器官功能障碍，严重者发生休克甚至死亡[1]。血培养是BSI诊断的金标准，快速、准确地确定病原菌信息，及时对症用药是临床治疗BSI的关键[2]。若在起病初期24～48h内进行有效地抗生素治疗，可明显降低BSI的病死率[3]。然而，目前的血培养检验流程中，血培养瓶报阳后，仍需36～48h才能得到最终的菌种鉴定报告[4]。近年来，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix
assisted laser desorption ionization time of flight mass
spectrometry， MALDI-TOF MS）技术已应用于血培养阳性标本的直接鉴定。但由于标本前处理过程较复杂、不同菌种鉴定符合率有明显差异，使其不能完全取代固体培养基的传代培养。因此，本文针对阳性血培养，采用MALDI-TOF MS技术对分离胶促凝管联合十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）前处理标本直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定相结合，探讨血培养阳性标本中不同菌种快速鉴定的最佳时间。
1.1 研究对象 收集2020年8月～2021年1月来源于咸阳市第一人民医院微生物室的243瓶血培养阳性样本进行分析。入选标准：BacT/ALERT 3D全自动血培养仪发出阳性报警，阳性瓶经常规涂片革兰染色镜检确认为一种形态的细菌。排除标准：报阳血培养瓶经常规涂片革兰染色镜检发现多种形态细菌和/或真菌。如同一患者同时多瓶血培养报阳，取最先报阳的血培养标本进行检验。
1.2 仪器与试剂 BacT/ALERT 3D全自动血培养仪，VITEK MS微生物质谱检测系统，VITEK 2 Compact微生物鉴定及药敏分析系统（法国BioMrrieux公司）；
哥伦比亚血琼脂平板和麦康凯平板（郑州安图生物工程股份有限公司）；
血培养瓶，MS P96孔靶板和CHCA基质液，甲酸和乙腈（法国BioMrrieux公司）；
十二烷基硫酸钠和乙醇（天津市天力化学试剂有限公司）；
革兰染色液（珠海贝索生物技术有限公司）；
分离胶促凝管（江苏康捷医疗器械有限公司）；
大肠埃希菌（ATCC 8739）由法国生物梅里埃公司提供。
1.3 方法
1.3.1 传统方法：
BacT/ALERT 3D全自动血培养仪中的血培养瓶报阳后，转种哥伦比亚血琼脂平板和麦康凯平板，经35 ℃，5ml/dl CO2环境培养24h，取纯菌落，采用VITEK MS或VITEK 2 Compact鉴定，并以此结果为金标准，比较SDS前处理和固体培养基短时培养应用MALDI-TOF MS鉴定的符合率。
1.3.2 分离胶促凝管联合SDS前处理后 MALDITOF MS直接鉴定：标本前处理参照周春妹等[5]报道分离胶促凝管联合SDS方法。MALDI-TOF MS鉴定按照VITEK MS操作程序进行。
1.3.3 固相培养基短时培养生长菌膜鉴定：取0.5ml血培养阳性样本转种于哥伦比亚血琼脂平板上密集划线，置35 ℃，5ml/dl CO2环境培养。分别取2h，4h和6h培养的菌膜采用VITEK MS鉴定。
1.4 统计学分析 实验数据应用SPSS 22.0软件进行统计分析。SDS前处理法直接鉴定和固体培养基短时菌膜鉴定符合率比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定结果 见表1、表2。243例单一菌血培养标本，经传统方法培养鉴定，分别为23种革兰阴性菌153株（62.96%）和21种革兰阳性菌90株（37.04%）。分离率前五位的细菌分别为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
表1 243例单数菌SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定结果
表2 各菌属SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定结果及符合率[n（%）]
2.2 革兰阳性菌(G+菌)和革兰阴性菌（G-菌)SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定符合率 见表3。革兰阳性菌中，SDS前处理法直接鉴定未鉴定出36株（40.00%，36/90），以葡萄球菌属最多（30株），其中83.33%（25/30）为凝固酶阴性葡萄球菌。少见菌阴道加德纳菌、藤黄微球菌、纹带棒状杆菌、单核细胞增生李斯特菌及溶血隐秘杆菌全部正确鉴定到种。
表3 G-菌和G+菌SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定符合率（%）比较
革兰阴性菌中，SDS前处理法直接鉴定错误2株（1.31%，2/153），为克氏柠檬酸杆菌和恶臭假单胞菌各1株。3株聚团泛菌鉴定结果较差，MALDITOF MS直接鉴定和6h菌膜分别鉴定正确1株；
水生丛毛单胞菌仅6h生长菌膜鉴定正确，恶臭假单胞菌6h生长菌膜符合率为50%（1/2）；
6株马耳他布鲁菌两种鉴定方法均无结果，延长培养至8h可正确鉴定到属。
除6h培养菌膜外，SDS前处理法直接鉴定和2h，4h生长菌膜鉴定，革兰阴性菌符合率均高于革兰阳性菌，差异有统计学意义（χ2=17.880～37.808，均P＜0.01）。
2.3 肠杆菌和非发酵菌SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定符合率 见表4。肠杆菌鉴定符合率均高于非发酵菌，仅4h培养菌膜鉴定比较差异具有统计学意义（χ2=4.993，P＜0.05）,其余差异均无统计学意义。
表4 肠杆菌和非发酵菌SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定符合率（%）比较
2.4 主要革兰阳性菌SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定符合率 肠球菌属、链球菌属、葡萄球菌属SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定符合率比较见表5。金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌鉴定符合率比较见表6。金黄色葡萄球菌SDS前处理法直接鉴定和2h，4h生长菌膜鉴定符合率均高于凝固酶阴性葡萄球菌，差异有统计学意义（χ2=4.795，12.083, 9.035，均P＜0.01）。
表5 主要革兰阳性菌SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定符合率（%）比较
表6 金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌SDS前处理法直接鉴定与固体培养基短时培养菌膜鉴定符合率（%）比较
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)是目前微生物实验室的常用工具，可显著缩短病原菌的鉴定时间[6]。与传统方法相比，通过MALDI-TOF MS从阳性血培养标本中直接鉴定微生物，可明显缩短鉴定时间[7]。此方法需要对样品进行浓缩和纯化，包括离心和洗涤、选择性裂解血细胞、血清分离或过滤等过程。目前，国外已有三个主要的商品试剂盒[8]用于血培养阳性标本的前处理。
虽然商品试剂盒易于标准化，但由于试剂盒成本高等原因，国内实验室多采用自制试剂用于血液标本的处理[2,5，9-12]。本研究参考周春妹等[5]分离胶管联合SDS改良法处理标本，采用MALDI-TOF MS直接鉴定，结果与文献[5]比较，革兰阳性菌的符合率较低，其它结果基本一致。主要为凝固酶阴性葡萄球菌鉴定符合率低，这与侯伟伟等[2]的研究结果一致，高于方毅等[13]的结果。总符合率与分离胶管联合Bruker质谱直接鉴定[3,10,14]结果也一致。分离率前五位的细菌除表皮葡萄球菌外，其余四种菌直接鉴定符合率均大于70%，其中肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌为100%。可见，采用自制试剂处理标本，通过MALDI-TOF MS技术，可准确鉴定血流感染的主要病原菌。
美国运用溶解过滤法处理标本，同时使用处理后过滤器上的细菌直接制备菌悬液，联合VITEK 2 Compact进行药敏试验，使得血培养瓶报阳到鉴定及药敏试验的中位时间缩短至9.9h[15]。BROYER等[6]通过自动化处理，实现了靶板制备的标准化，提高了种鉴定水平，同时可“按需”和“小批量”操作，节省了时间和人力。谷钰峰等[16]将MALDITOF MS技术与流式细胞学联合应用于BSI病原体的快速鉴定及药敏试验，使得报告时间更缩短至3h以内。自动化的标本前处理操作，可显著提高MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性标本的准确率,联合前处理纯化菌液快速药敏试验可为临床抗感染治疗提供更快更可靠的依据。
不同菌种，SDS前处理法MALDI-TOF MS直接鉴定的符合率存在差异。总的来说，革兰阴性菌高于革兰阳性菌，原因可能为血培养中革兰阳性菌污染概率大于革兰阴性菌，而污染菌的菌量比较少，且革兰阳性菌有较厚的难被破坏的细胞壁，从而导致VITEK MS直接法鉴定准确率低[2]。凝固酶阴性葡萄球菌的鉴定符合率明显低于金黄色葡萄球菌，对于二者具有一定的鉴别诊断意义[11]。HAMILTON等[17]研究结果显示，对于血培养中未能直接鉴定的葡萄球菌，在低风险或低流行率地区，可排除金黄色葡萄球菌菌血症。林晓晖等[18]利用VITEK MS 的 Launch pad 软件对细菌所产生的质谱峰质荷比（M/Z）进行分析，可快速鉴别甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)及 甲 氧 西 林 敏感的金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)，为抗感染治疗提供更精准的依据。
由于血培养报阳时间不一致，批处理不能实现快速鉴定，单独处理样本相对费时费力。加之凝固酶阴性葡萄球菌、某些革兰阴性菌及一些少见菌等，SDS前处理法直接鉴定效果不佳，故本研究同时利用MALDI-TOF MS鉴定血平板上短时生长菌膜，以进一步缩短阳性血培养鉴定时间和鉴定符合率。
文献[19]报道，血培养阳性标本中的革兰阴性杆菌采用MALDI-TOF MS成功鉴定菌种的平均时间仅为2.0h，而革兰阳性球菌为5.9h。本研究结果显示，革兰阴性菌2h菌膜鉴定符合率为59.48%，低于直接鉴定结果；
而革兰阳性菌6h菌膜鉴定符合率达86.67%，高于直接鉴定结果。故对于革兰阴性菌本研究结果直接鉴定效果更佳，而革兰阳性菌6h菌膜鉴定符合率更高。二者4h菌膜鉴定符合率与MALDI-TOF MS直接鉴定的数据接近，其中肠杆菌科细菌与金黄色葡萄球菌的鉴定符合率最高，非发酵菌低于肠杆菌，可能与其在固体培养基生长相对较慢有关。6h生长菌膜与吴富炜等[20]的研究结果一致,高于HA等[21]的研究结果。周道红等[22]报道革兰阳性菌4h菌膜与革兰阴性菌2h菌膜鉴定结果均高于本研究，可能与病原菌数量及菌种分布有关。
相比于MALDI-TOF MS直接鉴定，固体培养基短时生长菌膜质谱鉴定不需要特殊试剂和标本处理，可通过随时查看培养基上菌膜生长状态即时鉴定，更适宜对单个或小批量样本的鉴定。结合本研究结果及血液培养技术用于BSI诊断临床实践专家共识[23],本研究团队建议：①血培养报阳后首选MALDI-TOF MS直接鉴定，约85%的革兰阴性菌及60%的革兰阳性菌可在1～2h内被准确鉴定到种；
②对于鉴定失败的革兰阳性球菌，直接选择6h生长菌膜进行鉴定，因为2h和4h生长菌膜鉴定符合率并不优于直接鉴定。对于鉴定失败的葡萄球菌，若本地区金黄色葡萄球菌BSI率较低，可提示临床金黄色葡萄球菌感染的可能性不大。③对于未能进行直接鉴定的标本，革兰阴性菌可选择2h生长菌膜进行鉴定，如失败再对4h生长菌膜进行鉴定。革兰阳性球菌则培养至4h鉴定，如失败再对6h生长菌膜进行鉴定；
④报阳时长大于2天且曲线平缓者建议直接选择6h生长菌膜鉴定，如报阳曲线及涂片结果疑似布鲁菌，则培养至8h再鉴定。
MALDI-TOF MS已被证明是一种快速、可靠的直接鉴定血培养瓶中病原体的方法[24]。本研究结果表明，MALDI-TOF MS技术可对BSI主要病原菌进行快速直接鉴定，根据革兰染色结果联合固体培养基短时培养生长菌膜质谱鉴定，可进一步缩短细菌鉴定时间，为临床抗感染治疗提供早期依据。
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