李泰阶，蒋诚传，林青
(广西医科大学附属武鸣医院医学检验科，南宁 530199)
磷霉素是一种由链霉菌属合成的天然抗生素，具有特殊的化学结构，化学名为(1R，2S)-1，2-环氧顺丙烯磷酸。磷霉素口服30%～40%可由胃肠道吸收，且不受食物的影响，2～4 h血药浓度达到峰值。其不与血浆蛋白进行结合，半衰期为1.5～2.0 h。磷霉素进入人体后组织分布广，以肾组织中浓度最高，其次为心、肺、肝等器官组织。磷霉素对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌有较好的抗菌活性。近年来，磷霉素因其特殊的杀菌机制和理化性质、无交叉耐药、抗菌活性强、组织分布广泛、联合用药时呈现协同杀菌作用等优点，重新进入临床并在治疗多重耐药菌引起的感染中发挥重要作用[1]。随着磷霉素耐药性的增加，分析并研究磷霉素的耐药机制，减缓耐药性产生，延长其临床使用寿命具有重要意义[2]。现对磷霉素细菌耐药机制进行阐述，以为磷霉素临床合理使用、减缓其耐药性的产生和传播及开发新型抗菌药物提供新思路。
磷霉素是一种广谱抗菌药物，于1969年由西班牙CEP公司和美国MERCK公司在链霉菌发酵液中首次发现[3]。磷霉素是一种天然抗生素，虽然部分菌种可产生磷霉素，但其产量普遍偏低。2006年，美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的一个科研团队通过分子克隆技术成功获得磷霉素生物合成基因工程菌株，至此磷霉素的产量得到大幅提升[4]。磷霉素是一种磷酸衍生物，分子量极低，几乎不与蛋白质结合。磷霉素是一种独特的抗菌药物，其化学结构与现有的抗生素差别较大。磷霉素的分子结构在不同药物剂型也存在一定差异。其有两种口服剂型：磷霉素钙(C3H5CaO4P)和磷霉素氨丁三醇(C3H7O4P·C4H11NO3)；
一种静脉注射剂型：磷霉素二钠(C3H5Na2O4P)[5]。
磷霉素对细菌的抗菌活性主要通过抑制细菌细胞壁合成中的第一步酶催化反应，干扰肽聚糖前体二磷酸尿苷-N-乙酰胞壁酸的形成。MurA(UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase)通过催化磷酸烯醇式丙酮酸转移到二磷酸尿苷-N-乙酰葡糖胺的3′-OH端而参与肽聚糖生物合成，这是合成肽聚糖的第一个重要步骤。磷霉素是磷酸烯醇式丙酮酸的类似物，因此能代替磷酸烯醇式丙酮酸与MurA活性中心半胱氨酸的巯基进行不可逆的共价结合，使MurA失活；
进而抑制二磷酸尿苷-N-乙酰氨基葡萄糖-烯丙基丙酮酸的生物合成，使细菌细胞壁的合成停滞，从而发挥杀菌作用[6]。在鸟嘌呤和胞嘧啶百分比含量较低的革兰阳性菌中存在两种“murA”基因(murA和murZ)，其基因产物在结构上非常相似。在肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌中，两个基因表达产物均能维持肽聚糖的合成，MurA和MurZ两种同工酶对磷霉素均很敏感[7]。
磷霉素主要在细菌的生长阶段发挥作用。细菌需要N-乙酰胞壁酸合成肽聚糖，而磷霉素可干扰肽聚糖的合成，因此磷霉素对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌具有广泛的活性。但少数细菌，如头状葡萄球菌、腐生葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、结核分枝杆菌和沙眼衣原体等对磷霉素天然耐药。因磷霉素独特的杀菌机制、较好的抗菌活性，不易与其他抗菌药物产生交叉耐药性，其已广泛应用于多重耐药菌感染的治疗，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、耐青霉素肺炎链球菌、产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌科细菌、产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌和耐碳青霉烯铜绿假单胞菌等[8]。
随着磷霉素在临床的广泛使用，细菌对其耐药率逐渐显现。细菌对磷霉素的耐药机制主要包括五大类：①磷霉素靶酶MurA的突变及过表达；
②磷霉素摄取减少；
③磷霉素修饰酶表达；
④磷霉素外排泵机制；
⑤磷霉素异质性耐药。
3.1磷霉素靶酶MurA突变及过表达 磷霉素靶酶MurA活性位点特别是磷霉素结合位点的突变，包括周边氨基酸替换，均可导致MurA对磷霉素的结合减少，使细菌对磷霉素出现耐药。MurA氨基酸序列第115位半胱氨酸的巯基与磷霉素发生不可逆的共价结合后，MurA失活。当MurA氨基酸序列第115位半胱氨酸突变成天冬氨酸后，MurA失去与磷霉素结合能力；
磷霉素不能阻断细菌壁的合成，导致细菌对磷霉素耐药[9]。MurA氨基酸序列中其他位置发生突变也可导致其与磷霉素无法结合。研究发现，MurA的第369位(Asp369→Asn369)和370位(Leu370→Ile370)氨基酸发生突变，可导致细菌对磷霉素耐药[10]。此外，MurA过表达也可导细菌对磷霉素耐药。当诱导MurA过表达后，大肠埃希菌对磷霉素表现出耐药[11]。murA转录增强可导致产志贺毒素大肠埃希菌对磷霉素耐药[12]。对磷霉素耐药的肠球菌的研究显示，部分菌株MurA的氨基酸序列发生多个氨基酸替换；
部分肠球菌携带fosB；
部分肠球菌高水平表达fosX[13]。
3.2磷霉素摄取减少 磷霉素需要借助转运摄取系统将其转运至细胞内才能发挥抗菌活性。当转运摄取系统编码基因发生碱基缺失或突变导致转运蛋白功能缺失时，细菌无法将磷霉素运输至细胞内而导致耐药。细菌对磷霉素转运主要依赖葡萄糖-6-磷酸转运系统(glucose-6-phosphate transporter，UhpT)和甘油-3-磷酸转运系统(glycerol-3-phosphate transporter，GlpT)。其中，GlpT属于MFS(major facilitator superfamily)超家族外排转运蛋白；
有12个跨膜α-螺旋结构的内膜蛋白，主要转运营养成分和各种离子[14]。uhpT表达需要外源性6-磷酸葡萄糖的诱导，而glpT可在不依赖6-磷酸葡萄糖的条件下在细菌体内持续表达。UhpT和GlpT的编码基因均由染色体编码；
染色体编码基因及其调控基因发生突变均可导致磷霉素转运摄取减少，最终导致细菌对磷霉素耐药[15]。Takahata等[10]对临床分离的磷霉素耐药大肠埃希菌murA、uhpT、glpT进行了序列分析，发现大肠埃希菌GlpT氨基酸序列发生替换，并与甘油-3-磷酸及磷霉素的摄取减少密切相关；
glpT的C端发生基因片段的插入或丢失，导致细菌对磷霉素耐药；
部分大肠埃希菌uhpT出现丢失。Nilsson等[16]在研究大肠埃希菌对磷霉素的耐药机制时发现，uhpT和glpT均出现基因突变、重复序列、插入序列；
同时他们还发现，uhpT和glpT在体内和体外的突变率存在显著差异。
UhpT或GlpT的调控基因包括uhpA、cyaA和ptsI，其编码的调控蛋白分别为UhpA、CyaA和PtsI。UhpA促进UhpT的表达；
uhpA编码uhpT启动子转录激活所需的反应调节蛋白，当uhpA发生碱基缺失或突变时可抑制uhpT的表达[17]。glpT的表达受环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)-受体蛋白复合物的调控。当cAMP-受体蛋白复合物结合到glpT的特异性启动子位点后促进其表达；
当细胞内cAMP表达下降可导致glpT表达下调[18]。PtsI和CyaA参与细菌体内cAMP的合成。ptsI和cyaA的突变导致细胞内cAMP水平降低，下调GlpT和UhpT转运蛋白的表达，从而减少细菌对磷霉素的摄取，使细菌对磷霉素耐药[19-20]。
3.3磷霉素修饰酶表达 多种修饰酶可通过共价修饰裂解磷霉素的环氧化物部分的碳氧键使其失活。目前已发现的修饰酶可分为金属酶(包括FosA、FosB、FosC和FosX等)和激酶(包括FomA和FomB)。其中，金属酶通过添加各种底物打开环氧化物环使磷霉素失活[21]。激酶主要通过磷酸化使磷霉素失活。
FosA是一种谷胱甘肽-S-转移酶，以Mn2+和K+作为辅因子，其通过催化谷胱甘肽添加到磷霉素的C1位置，破坏环氧化物环[22]。fosA最早被发现存在于黏质沙雷菌的质粒TN2921转座子上。fosA主要存在于肠杆菌科、假单胞菌属和不动杆菌属中[23]。而其他质粒携带的谷胱甘肽转移酶基因，如fosA2、fosA3、fosA5和fosA6也相继被发现[10，24]。FosA2与FosA在氨基酸序列上具有95%的同源性[25]。fosA5编码含139个氨基酸的蛋白质酶；
FosA5在氨基酸序列上与FosA、FosA2、FosA3和FosA4有69%～80%的同源性[26]。fosA常与其他耐药基因共存于同一质粒，如gyrA、parC、parE、CTX-M、floR、dfrA7、sul1、sul2、aadA5、aphA6、mphA、KPC、NDM；
导致细菌对磷霉素、氨基糖苷类、喹诺酮类、β-内酰胺类、大环内酯类、磺胺类等抗菌药物产生共同耐药[27]。
目前，我国大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对磷霉素的耐药机制主要由fosA3介导[28]。有文献报道，7.8%的大肠埃希菌对磷霉素不敏感，其中80%的菌株携带fosA3；
42%菌株携带的fosA3可通过质粒转移[29]。另一项研究显示，在产KPC酶肺炎克雷伯菌中，60.8%的菌株对磷霉素耐药；
在优势克隆菌株中，fosA3和blaKPC-2位于同一个质粒上[30]。在日本分离的一株大肠埃希菌，fosA3与CTX-M位于同一质粒上[31]。
FosB是一种Mg2+依赖的L-半胱氨酸巯基转移酶，其氨基酸序列与FosA有48%的同源性[32]。FosB主要由革兰阳性细菌产生，包括枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌等[33]。这些细菌不产生谷胱甘肽，但使用杆菌硫醇作为供体。金黄色葡萄球菌的fosB由染色体编码，其与磷霉素的活性相关。金黄色葡萄球菌因fosB或杆菌硫醇合成机制的缺失大大增加了其对磷霉素的敏感性[34]。
FosC最早分离自产磷霉素的丁香假单胞菌PB-5123菌株中[35]。该蛋白酶由182个氨基酸残基构成，分子量为19 000。FosC使用ATP作为底物向磷霉素添加磷酸基团使磷霉素失去活性；
该反应可以被碱性磷酸酶逆转。Wachino等[36]在研究CTX-M型大肠埃希菌对磷霉素耐药性时首次发现FosC2。FosC2是FosC亚型，由132个氨基酸组成，其氨基酸序列与木糖氧化无色杆菌中分离的FosC具有72%的同源性[36]。FosC2可通过发挥谷胱甘肽-S-转移酶活性使磷霉素失活。
FosX是一种水解酶，与FosA和FosB具有30%～35%的序列同源性[37]；
但它是一种依赖于Mn2+的环氧化物水解酶，以水为底物，通过在磷霉素C1位置添加羟基并打开其环氧化物环使磷霉素失活。FosX 酶存在于单核细胞增生李斯特菌、肉毒梭菌和布鲁菌中[38]。
FomA和FomB是分离自产磷霉素细菌(如威德摩尔链霉菌和弗雷德氏链霉菌)的一种激酶；
并被证实通过磷酸化使磷霉素失活，阻止磷霉素的杀菌活性[39]。其中，FomA催化磷霉素磷酸基团磷酸化为磷霉素单磷酸；
FomB将磷霉素单磷酸转化为磷霉素二磷酸。上述两个化学反应均由ATP和Mg2+催化[40]。
3.4磷霉素外排泵机制 目前，关于外排泵机制导致磷霉素耐药的研究较少，仅见Tet38外排泵。Tet38外排泵是金黄色葡萄球菌染色体编码的MFS超家族外排转运蛋白，具有14个跨膜α-螺旋结构域，其底物包括多种化合物[41]。体外实验证实，质粒过表达tet38和glpT突变体的金黄色葡萄球菌对磷霉素最低抑菌浓度增加，同时细菌体内磷霉素含量降低，并受甘油-3-磷酸影响。当Tet38外排泵发生基因突变可导致细菌对磷霉素最低抑菌浓度降低，菌体内磷霉素浓度升高，说明Tet38是磷霉素的外排转运蛋白[42]。Xu等[43]通过分子生物学技术对磷霉素耐药的金黄色葡萄球菌进行研究发现，随着磷霉素浓度的增加，耐药菌tet38表达量增加。
3.5磷霉素异质性耐药 细菌异质性耐药是指分离菌株中含有细胞亚群，与主要群体相比，这些细菌亚群对抗生素的敏感性显著降低[44]。目前，磷霉素的异质性耐药研究主要集中于肺炎链球菌和铜绿假单胞菌。体外实验证实，肺炎链球菌对磷霉素可产生异质性耐药且同时表达MurA；
当敲除murA后，耐药菌株的异质性耐药现象消失[45]。与非异质性耐药菌株的不同，异质性耐药菌株MurA(Ala364→Thr364)中的单个氨基酸发生突变；
当将突变murA导入无异质性耐药菌株后，其异质性耐药现象并未出现，推测异质性耐药的原因是由多种机制共同导致。一项针对铜绿假单胞菌的研究，通过菌群谱分析法实验证实所有测试的铜绿假单胞菌中均存在异质性耐药；
时间杀菌实验显示，采用不同浓度的磷霉素处理后均可导致对磷霉素敏感的菌株完全被磷霉素耐药菌株所取代[46]。
细菌对磷霉素的耐药可以通过MurA的突变及过表达、磷霉素摄取减少、修饰酶表达、外排泵机制和异质性耐药等机制单独或联合发挥作用。重新回归临床的磷霉素，不仅具有广谱抗菌效果，同时具有良好的药动学特点，对多重耐药菌株仍具有较高的敏感性。当前，全球面临多重耐药菌抗感染与治疗的重大挑战，因此如何能够减缓部分安全经济的经典抗菌药物(磷霉素等)耐药性的产生和耐药传播的速度具有重要意义。未来，深入研究磷霉素的耐药机制、传播机制以及制订合理的用药方案将为临床治疗多重耐药菌引起的感染提供广阔的应用前景。
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