张松梅，王鑫文，代琦，邓成松，鲁金强，余世祥，吴绍伟，张以芳，柴俊
（1.德宏州尚善品味农业有限公司，云南梁河 679200；
2.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201）
牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCoV）是引起犊牛腹泻的常见病原。15 日龄内犊牛感染BCoV 后死亡率较高，而成年牛多呈一过性或隐性感染，死亡率较低，但长期带毒。BCoV 可使感染牛群出现腹泻、产奶量下降、免疫力降低等问题，严重者甚至死亡，即使病愈也会对其生长、生产性能有一定负面影响，对养牛业造成较大经济损失。
BCoV 为单股正链RNA 病毒，属于套病毒目冠状病毒科正冠状病毒亚科β 冠状病毒属成员[3]，基因组全长27～30 kb，包括10 个开放阅读框（ORF1～10），两端是5"和3"非翻译区域。其中，ORF1 编码多聚蛋白PPIA，ORF3、ORF4、ORF8、ORF9 和 ORF10 分别编码血凝素酯酶蛋白、刺突糖蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）等结构蛋白[4]，其中N基因较为保守，常用于检测引物设计和诊断试剂研发。
BCoV 在我国广泛存在[1-2，5，8-11]，但在其云南省的流行情况未见详细报道。本研究针对云南省部分地区规模化牛场和周边散养牛场不同年龄奶牛和肉牛样品进行BCoV 检测及分子流行病学调查，以补充云南省BCoV 分子流行病学数据及其遗传特征，从而为云南省牛BCoV 感染防控提供参考。
1.1 病料来源与处理
样品来自2021—2022 年云南省大理、陆良、石林、寻甸等4 个地区5 家牛场不同年龄牛的粪便样品357 份（表1），包括61 份腹泻样品和296份非腹泻样品。取样品加入适量无菌PBS 缓冲液稀释混匀，反复冻融3 次，按照RNA 提取试剂盒说明书进行病毒总RNA 提取，根据反转录试剂盒说明书进行cDNA 合成，并置于-20 ℃保存备用。
表1 2021—2022 年4 个地区不同年龄牛粪便样品信息统计单位：份
1.2 主要试剂和仪器
RNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、核酸染料、DL 2 000 DNA Marker、DL 5 000 DNA Marker、2×EasyTaqSuperMix、感受态细胞DH5α、PMD19-T 载体、AMP、IPTG、X-gal，均购自北京全式金生物有限公司；
LB 肉汤、LB 琼脂，购自青岛海博生物科技有限公司；
试验所用仪器，均由云南农业大学动物医学院预防兽医实验室提供。
1.3 引物设计与合成
参 考GenBank 已公布的BCoV毒株（AF391542、EF424616、MN982199.1）序列，利用引物设计软件Primer 5.0 和oligo 7，针对N基因设计1对检测引物以及1对扩增完整N基因的引物。引物具体信息见表2，由昆明擎科生物科技有限公司委托合成。
表2 BCoV 引物信息
1.4 样品RT-PCR 检测与BCoV N 基因测序
以1.1 中处理好的cDNA 为模板，用所设计的BCoV 检测引物进行PCR 扩增。反应体系25.0 μL：2×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，dH2O 9.5 μL，BCoV 上下游检测引物各1.0 μL，模板1.0 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性40 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，扩增35 个循环。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。以BCoV 检测为阳性的cDNA 为模板，利用设计的N基因扩增引物进行PCR 扩增，PCR 反应体系与检测相同。反应程序：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性40 s；
59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 个循环。扩增产物经电泳后用胶回收试剂纯化，连接至pMD19-T 载体，转化至DH5α 感受态细胞中，经蓝白斑筛选，提取重组克隆质粒进行PCR 鉴定，然后送昆明生工生物科技有限公司测序。对测序结果使用DNAstar 软件剪切拼接，将拼接序列在NCBI上进行BLAST 比对，用DNAstar、MEGA 7.0 等软件进行同源性分析、遗传进化树绘制。
2.1 样品RT-PCR 检测
通过RT-PCR 方法对357 份样品进行BCoV检测，共检出51 份阳性样品，平均阳性检出率为14.29%，4 个地区5 家牛场均有阳性检出，阳性检出率为11.53%～17.54%（表3）。阳性样品扩增出与预期目的片段大小相符的450 bp 条带，部分样品的1%琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
表3 临床样品BCoV 阳性检测结果统计
图1 部分样品的BCoV PCR 检测结果
不同年龄牛的样品中均检出BCoV阳性，其中，1 周龄—1 月龄犊牛的阳性检出率最高，为19.23%（5/26），1 岁及以上次之，为17.31%（9/52），1 周龄和1～6 月龄相对偏低，分别为10.00%（2/20）和10.81%（28/259）。腹泻和非腹泻样品中均有BCoV 阳性检出，其中腹泻样品阳性检出率为36.07%（22/61），非腹泻样品为9.78%（29/296）。
2.2 N 基因PCR 扩增、克隆及鉴定
挑选各牛场最具代表性的BCoV 阳性样品进行N基因扩增，结果成功扩增到4 条长度为1 412 bp的N基因序列（BCoV-YN01、BCoVYN02、BCoV-YN03、BCoV-YN04），经克隆鉴定与预期目的片段大小一致（图2～3）。
图2 BCoV N 基因扩增结果
图3 BCoV N 基因克隆鉴定结果
2.3 N 基因序列分析
对测序序列进行拼接、剪切，获得4 条长1 347 bp 的完整N基因序列，分别为BCoVYN01-2021（大理）、BCoV-YN02-2021（陆良）、BCoV-YN03-2021（石林）、BCoV-YN04-2021（寻甸）。
2.3.1N基因同源性及遗传进化分析 应用DNAstar 软件中的MegAlign 进行4 条核苷酸序列及其推导氨基酸序列进行同源性分析，结果发现其同源性分别为99.0%～99.8%、98.2%～100%。4条N基因序列与GenBank 中的45 条（表4）参考毒株N基因序列同源性为97.7%～99.8%，氨基酸相似性为97.3%～100%；
与15 条我国参考毒株核苷酸同源性为97.7%～99.9%，氨基酸相似性为98.0%～100%；
与Mebus 原始毒株核苷酸同源性为98.1%～98.2%，氨基酸相似性为98.4%～98.7%。将4条N基因序列与GenBank 中46 条各地区BCoV毒株N基因序列，用MEGA 11 软件构建NJ 进化树。从进化树（图4）中可看出：4条N基因序列与近几年的我国四川毒株构成一个小分支，亲缘关系较近；
其中BCoV-YN02-2021（陆良）和BCoVYN03-2021（石林）距离较近，BCoV-YN01-2021（大理）和BCoV-YN03-2021（陆良）相距较远；
4 条序列与美国4-17-03、7-16-23、4-17-25 和日本GF2020 等毒株处于同一个大分支且遗传距离较近，推测具有共同的祖先，与原始毒株Mebus 处于不同的大分支且亲缘关系较远。
调查[2，5-8]显示，BCoV 在我国广泛存在，各地BCoV 抗原阳性率为20%～35%。彭昊等[9]2020年对广西47 份粪便样品进行RT-PCR 检测，发现BCoV 检出率为17%；
何琪富[10]2019 年对青藏高原地区336 份牦牛粪便进行RT-PCR 检测，发现BCoV 检出率为69.05%；
阿比克哈莫[11]2018年用PCR 法对我国6 个省14 个农场腹泻犊牛进行BCoV 检测，发现平均检出率为18.95%。本研究通过RT-PCR 方法检测了云南省4 个地区5 家牛场牛的粪便样品，发现BCoV 检出率为11.53%～17.54%，平均为14.29%。虽然本次检测的病毒阳性检出率比国内一些畜牧业大省低，但这4个地区5 家牛场不同年龄牛的腹泻及非腹泻样品中均检出BCoV 阳性，提示BCoV 在云南省的流行范围可能较广，对云南省养牛产业发展构成了潜在威胁。本次检测发现，1 周龄—1 月龄犊牛BCoV检出率最高，为19.23%，其原因可能与母源抗体下降而个体免疫机制不成熟有关；
1 周龄和1～6 月龄的牛群BCoV 检出率最低，分别为10.00%和10.81%，可能与1 周龄阶段犊牛母源抗体较高，1～6 月龄阶段犊牛个体免疫机制逐渐成熟，对病毒免疫耐受有关；
1 岁以上牛的BCoV 检出率也较高（17.31%），可能与该年龄段牛群暴露于病毒的时间较长相关。由于奶牛发情、分娩前后机体免疫和荷尔蒙紊乱，分娩和产后2 周时间内BCoV排出量也可能比平时增加65%～71%，因此这或许也是该年龄段病毒检出率较高的原因。本研究从非腹泻样品也检出BCoV 阳性，说明存在牛的BCoV隐性感染，这与已发表的研究[11]结果相符。
表4 GenBank 中BCoV 参考毒株信息
图4 BCoV N 基因遗传进化树
N 蛋白作为衣壳蛋白，可以使BCoV 的复制与释放更加高效，同时基因序列高度保守，并且在原核表达系统中能稳定表达，在不同毒株中核苷酸序列同源性可达98%以上，因而N基因通常作为PCR 检测和ELISA 试剂盒研发的靶基因。本研究获得的4 条BCoVN基因全核苷酸序列与国内外毒株相似性较高；
在遗传进化树中与其他国内流行毒株聚拢，呈单独进化趋势。由此推测，云南流行毒株与国内其他流行毒株存在共同的祖先，病毒随各省间的动物调运或引种在全国范围内传播。
综上所述：云南省牛群中可能广泛存在BCoV流行，尤其是1 周龄—1 月龄犊牛感染发病风险较高；
云南流行毒株与国内流行毒株亲缘关系较近，提示存在病原跨地区传播风险。因此，需加强BCoV 流行的监测与控制，严格进行检疫，加快疫苗研发和应用。