陈海云，邱英华，滕丽琼，郑苏华
（南宁众册生物科技有限公司，广西壮族自治区 南宁 530007）
柑橘黄龙病（Cirtus huanglongbing，HLB）是世界柑橘生产中的一种破坏性病害，主要分布在近50个国家和地区，包括亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北部地区[1]。目前，初步认定柑橘黄龙病病原菌由限制于韧皮部的难养细菌（Candidatus Liberobacter）引起，该病原菌属于革兰氏阴性细菌，暂时还不能人工培养。根据传播媒介和病原的热敏性及病原菌16S r DNA和β-操纵子基因的序列特征，将柑橘黄龙病菌分为非洲种、亚洲种和美洲种[2]。病原菌严重影响寄主韧皮部，可引起叶片黄化、果实商品价值降低、枝条枯梢和树体死亡[3]。黄龙病的自然传播方式主要为柑橘木虱传播、人为传播和菟丝子传播等方式，传播途径复杂且范围广，防控难度大[4]。近几年来，广西区柑橘类水 果面积快速扩大，根据广西区统计局统计，广西柑橘种植面积60×104hm2，产量1 000×104t，是广西农村经济的支柱产业之一，在农民脱贫致富奔小康和新农村建设中发挥着重要作用。种植面积的急速扩大使得柑橘感染黄龙病的染病危险系数大增，广西区内柑橘黄龙病发生面积达867 hm2，一旦出现重大病情，将会对广西果业与经济造成沉重打击。
柑橘黄龙病是柑橘生产中的重大病害，其病原菌能够侵染柑橘及其近缘属植物，目前尚无有效的防治方法，仍以防控为主。通常只能采取连根挖除并烧毁染病植株的办法，防止黄龙病菌扩散，中断传染源。如能在早期发现、甄别黄龙病病菌，及时切断传染源控制黄龙病蔓延，对保障柑橘产业的健康发展具有重要现实意义，因此，研究开发一种能快速、准确、安全的诊断柑橘黄龙病的检测技术成为柑橘黄龙病防控及柑橘产业健康发展的迫切需求。
建立一种快速、准确、高效的检测方法，对柑橘黄龙病的检测具有重要意义。而重组酶介导的等温核酸扩增（Recombinase-acidAmplification，RAA）技术是一种利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶,替代了PCR高温变形循环过程，在37℃恒温条件下快速、灵敏检测目的基因片段[5]。具体原理为：从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA、单链结合蛋白紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白（single-stranded DNA binding，SSB）的帮助下，使模板双链DNA解旋，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。单链结合蛋白（SSB）防止单链DNA复性，在能量和dNTP存在的情况下，由DNA聚合酶完成链的延伸，5～20 min便可完成扩增。此外，RAA技术还能够完成多重引物扩增，利用不同颜色的荧光标记，在同一个反应里检测到不同的目的基因[6]。
RAA技术具有以下技术优势：①操作简单，无需专业人员也可完成样本的分子层面检测；
②设备便携，能应对各种恶劣环境，实现移动执法，抗干扰强；
③5～15 min出检测结果，实现真正意义上的“快检”；
④37℃～39℃的常温恒温反应，无需另购热循环仪或其他昂贵设备；
⑤灵敏度高，特异性强，精准识别目标基因片段，所得结果准确无误；
⑥采取先进的冻干技术，将其制成干粉试剂，可直接上机检测，便于运输，操作更简便，避免反复冻融带来的误差和损耗。
本研究拟基于RAA技术建立柑橘黄龙病的检测方法。利用RAA技术建立黄龙病菌的检测体系，测试检测方法的特异性和灵敏性，评价RAA在黄龙病原检测方面的适用性。结合荧光探针建立荧光RAA反应体系，开展敏感性及特异性评价，评价荧光RAA在黄龙病原检测方面的适用性。建立侧流层析试纸条的AA-LFD方法，评价这种方法的灵敏度、特异性。固定试剂组分，组装成试剂盒，进行试剂盒灵敏度、特异性、保存方式、保质期、稳定性等方面的测试。
1.1 试验样品
植物样品主要来自南宁各个县区的柑橘种植园，植株叶片出现原因不明的黄化现象。阴性对照为水果站提供的健康植株。
1.2 主要生物学试剂
DNA提取试剂盒为天根生物公司高效植物基因组DNA提取试剂盒，DNA Marker DL 2000购自宝生物工程（大连）有限公司，RAA恒温核酸快速扩增试剂（荧光型），即RAA扩增试剂，南宁众册生物科技有限公司自主研发生产冻干。2×Taqman PCR Mix购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3 主要仪器
Genchek RAA检测仪购自杭州众测生物科技有限公司。TGL-16MS高速冷冻离心机为上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品。Nanophotometer NP80 Touch微量紫外分光光度计为德国implen公司产品。
1.4 样品核酸提取
柑橘植株总基因组的提取方法参照杭州众测生物科技有限公司RAA基础型核酸扩增试剂盒。将少量酒精倒入研钵，研磨棒，药匙，后点燃进行灭菌消毒，待研钵冷却后，取少量新鲜柑橘叶脉，用剪刀剪碎后放入研钵中，一边加入液氮一边研磨，后续提取程序参照基因组提取试剂盒说明书。取1μL提取的基因组DNA在超微量分光光度计上检测样品浓度及纯度，260/280比值介于1.8～2.0。剩余样品置于-20℃冰箱贮藏备用。
1.5 RAA引物、探针的设计与合成
依据RAA引物设计原则，以NCBI数据库中50S核糖体亚基 基 因 序 列（MN117984.1、MN117983.1、MG384706.1、KY990824.1、KY550699.1、MN563116.1、MN563108.1、CP010-804.2、MK542517.1、MG256971.1）保守区域为靶位点，采用DNAMAN6.0软件进行序列比对分析，选取同源性高的片段，用Primer primer5.0设计了探针及4对引物（表1）。以标准质粒pUC57-50S（1×102copies/μL）作为模板，根据RAA荧光型反应对探针的要求对探针进行标记，以RAA荧光型核酸扩增试剂盒对引物进行筛选。扩增反应参照试剂盒说明书进行，反应条件为37℃、20 min。选择扩增效率最佳的1对引物。以上引物及探针均由北京六合华大基因科技有限公司合成，具体信息详见表1。荧光定量PCR引物探针序列见表2。
表1 RAA引物探针序列Tab.1 The sequence of RAA primer probe
表2 荧光定量PCR引物探针序列Tab.2 The primer probe sequence of fluorescent quantitative PCR
1.6 反应体系和反应程序
以上述提取的DNA为模板进行RAA检测。反应体系（50μL）：水27.4μL，20%PEG 12.5μL，上下游引物各2.0μL（引物浓度10μmol/L），探针0.6μL（探针浓度10μmol/L），DNA模版5.0μL，280 mmol/L乙酸镁2.5μL；
反应程序：预热阶段39℃40 s，1个循环；
循环阶段39℃，30 s（收集荧光信号），40个循环；
荧光通道：FAM。
PCR反应体系（25μL）：水5μL，2×Taqman PCR mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，探针0.5μL，模板5μL；
反应程序95℃10 min，循环阶段为95℃15 s，60℃20 s，共45个循环。
1.7 RAA荧光反应条件优化
比较RAA反应体系中PEG的终浓度为4%、4.5%、5%、5.5%、6%时的扩增效率；
比较醋酸镁浓度在260 mmol/L、270 mmol/L、280 mmol/L、290 mmol/L、300 mmol/L时的扩增效率，对反应条件进行优化。
1.8 RAA方法的特异性测试
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生李斯特菌、支气管败血波氏杆菌、Ⅱ型猪链球菌的参考菌株提取的DNA为模板，分别使用上述1.6反应体系和反应程序进行RAA检测，验证所建立方法的特异性。
1.9 RAA方法的灵敏度测试
50S核糖体亚基基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成克隆质粒。将质粒以10倍梯度进行稀释，浓度分别为1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL copies/μL、1×100copies/μL、1×10-1copies/μL。将稀释后的质粒分别作为质粒灵敏度试验的阳性标准品，对经梯度稀释的阳性标准品分别使用上述1.6反应体系和反应程序进行RAA检测，验证所建立方法的灵敏度。
1.10 样品检测
取1.4的提取的样本DNA作为模板，分别使用上述的反应体系和反应程序进行RAA检测和PCR检测，以掌握所建立方法对盲样的检测情况。在提取样品或菌株DNA的过程中，分别同时提取DEPC水作为阴性对照，用以验证提取过程是否出现DNA污染。
2.1 RAA引物筛选结果
样品采集按照相关标准采集，标本短期内可保存于-20℃。使用DNA快速提取试剂盒提取柑橘叶的DNA基因组，首先取柑橘叶片的主叶脉3～5条，用剪刀剪碎至1.5 mL离心管中。剪碎的样品加入300μL的Ll裂解液，用研磨棒将叶脉尽量研碎，再加入300μL的L2裂解液，混匀，短管离心30 s，取5μL上清作为模板，直接进行RAA扩增。样本检测操作步骤：向干粉反应管中加入42.5μL的ABuffer；
向干粉反应管中加入5.0μL经2.4处理得到的待测样本DNA，并同时设立阴阳性对照；
再向干粉反应管盖中加入2.5μL的BBuffer，盖上管盖，上下翻转混匀5～6次，低速离心10 s；
将干粉反应管放入Genchek系列荧光检测仪（或其他荧光定量PCR仪）中，选择RAA检测程序，开始检测。
以质粒pUC57-50S（1×10 copies/μL）作为模板，上下游各4条引物共16种组合进行RAA荧光反应，得出最佳引物组合F2/R3。以质粒pUC57-50S（1×102copies/μL）作为模板，上下游各4条引物共16种组合进行RAA荧光反应，结果显示，引物对F2/R3相对于其他引物对的出峰时间更早，荧光值更高（图1），因此选用引物对F2/R3为最佳引物。
图1 引物筛选结果Fig.1 The primer screening results
2.2 RAA荧光反应条件优化结果
经过反应条件优化，结果显示PEG终浓度在5%（图2A）、醋酸镁终浓度在280 nmol/L（图2B）时扩增效率最佳，与试剂盒中的反应体系相符。
图2 不同PEG和醋酸镁浓度下RAA荧光反应Fig.2 The RAA fluorescence reaction under different PEGand magnesium acetate concentrations
2.3 特异性试验结果
利用本试验建立的方法在ABI 7500实时荧光PCR仪及Genchek RAA检测仪上对不同病原菌进行特异性测试。结果显示，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生李斯特菌、支气管败血波氏杆菌、Ⅱ型猪链球菌及阴性对照均未出现扩增曲线，仅阳性对照出现扩增曲线。表明所建立的RAA荧光检测方法具有较强的特异性。
图3 特异性试验结果Fig.3 The specific test results
2.4 灵敏度试验结果
利用本试验建立的方法在ABI 7500实时荧光PCR仪及Genchek RAA检测仪上进行灵敏度测试，以荧光PCR作为对比。标准质粒浓度分别为1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL、1×100copies/μL、1×10-1copies/μL。结果显示荧光PCR法和RAA荧光法最低可检测到10拷贝/μL的质粒标准品。
图4 PCR 7500 Genchek的灵敏度图Fig.4 The sensitivity map of PCR 7500 Genchek
2.5 样品检测情况
采集的102份可疑柑橘叶样本提取核酸后在ABI 7500实时荧光荧光PCR仪及Genchek RAA检测仪上进行RAA荧光法的检测。与荧光PCR法进行对比RAA检出率要偏高一些，实时荧光定量阳性57份，阴性45份，阳性率44.12%。RAA实时荧光60份样本核酸为阳性，42份样本核酸为阴性，所建立的RAA荧光法在ABI 7500实时荧光PCR仪及Genchek RAA检测仪上的检测与荧光PCR检出符合率均为97%，表明所建立的RAA荧光法配合便携式Genchek RAA检测仪可用于现场检测。
目前，国内外已报道的相关柑橘黄龙病检测方法有田间诊断与指示植物检测、碘-淀粉沉淀法，显微镜观察法，血清学鉴定法等。分子生物学主方法主要有免疫学检测、PCR法、DNA杂交法、环介导等温扩增（LAMP）法，但是这些技术需要专业人士操作，且步骤较繁琐，等待时间也比较长，不太适合柑橘园中进行大规模的快速检测[7]。针对我国柑橘黄龙病目前暂无特效药剂防治仍需要以预防为主的现状，将现代分子生物学核酸检测技术应用于柑橘黄龙病的早期病菌筛查检测中，利用英、美归国科学家团队领衔开发的世界领先的重组酶介导链替换核酸扩增技术（简称RAA技术），建立黄龙病菌的检测体系，研发具有操作简单、设备便携、检测快速、常温反应、结果准确等特性的柑橘黄龙病RAA检测试剂盒，实现黄龙病早期病菌的快速准确检测，以尽早发现和甄别感染病菌植株，切断黄龙病传染源，对柑橘黄龙病的防控及柑橘产业的发展具有重要意义，同时弥补了广西柑橘黄龙病RAA检测技术的空白，有效带动南宁市植物病害核酸检测技术的发展及综合竞争力的提升。同时，通过项目的实施，进一步提高公司整体研发人员尤其是青年研发人员的技术水平，形成良好的研发机制及带头示范作用，进一步提升公司体外诊断试剂的整体研发水平及综合创新能力。
目前，RAA技术还处于初期阶段，正在不断优化反应温度、时间和结果判读方式[8]，但是对于一个刚出现的新技术而言，能够在体外37℃左右的温度下迅速扩增出目的片段，且反应时间仅需10～20 min，已经是很好的成绩，并已有科研单位研发出家用柑橘黄龙病分子诊断试剂盒。此外，RAA技术也是目前唯一可能研究出体内核酸扩增技术的后备技术。反应结果可通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光曲线监控、试纸条（侧流层析试纸条LFD）多种方式进行快速判读[9-11]。与其他DNA扩增技术相比，它不需要贵重的设备，能够在更短时间内和较低温度下扩增目的DNA。传统PCR和荧光PCR需要昂贵且体积较大的设备，反应时间也因核酸类别和片段大小而异，通常扩增时间都较长，常为50～150 min[10-13]。综合以上表明，RAA技术优势显著，具有便携、高效、高灵敏度、实用性广的特点，且对试验人员操作技术要求低，实验所需环境和设备要求不高，尤其适合于大规模的流行病学筛查和现场的快速检测。
本研究所建立的RAA检测方法能够准确鉴别出柑橘黄龙病。通过对方法的特异性、灵敏度、稳定性、盲样检测等一系列验证，证明所建立的检测方法对柑橘黄龙病病原菌具有显著特异性。本研究基于RAA所建立的黄龙病检测方法能够满足大规模果园的筛查和快速检测，相信随着反应体系和反应条件的不断优化，RAA法能够利用它的优势，在检测黄龙病方面广泛发挥作用。
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