刘福童， 李茂森， 陈敏， 张赛， 张福建， 王生才， 赵培炎， 宋安东，方明， 任天宝， 刘国顺
(1.河南农业大学/河南省生物炭研究工程技术中心/生物炭技术河南省工程实验室，河南 郑州 450002；
2.湖南省烟草郴州市公司，湖南 郴州 423000；
3. 安徽中烟工业有限责任公司， 安徽 合肥 230000)
湖南烟区是中国主要的烤烟产区之一，而郴州市是湖南省重要的烟叶生产区。烟叶种植过程中的连作和不合理的施用化肥等现象，都会导致植烟土壤肥力下降、酸化、板结、病害、虫害和土壤微生物群落改变等诸多问题[1-4]，进而影响烤烟经济效益。微生物是土壤的组成部分之一，而细菌是土壤微生物中数量最多的类群[5]，其群落结构和功能具有重要的作用，它的代谢产物和残留物可以影响土壤中物质循环、能量循环和土壤结构变化[6-8]。土壤酶是细菌代谢产物中重要的组成部分，其作用主要体现在土壤生物化学反应和细菌群落结构方面[9]。
高碳基土壤修复肥主要成分为生物炭、发酵饼肥和矿物质复配制成的一种新型生物碳基肥料[10]。近年来，高碳基土壤修复肥在农业生产中得到较大范围的推广，对土壤微生物多样性和群落结构的影响有着重要的作用[11]。研究高碳基土壤修复肥对烤烟根际土壤细菌群落结构及酶活性的影响，对其在烟草种植过程中的应用具有重要的意义。
目前，高碳基土壤修复肥在改良植烟土壤理化性状[12]，提高养分含量，促进烤烟生长和改善烤烟品质[13]等方面有较多研究，但有关高碳基土壤修复肥对烤烟根际土壤细菌群落结构及烟叶产值的影响尚不明确。为此，本研究以湖南郴州地区植烟土壤为研究对象，采用高通量测序技术研究高碳基土壤修复肥对烤烟根际土壤细菌群落结构及烟叶产值的影响，为烤烟根际土壤细菌调控、烟草栽培、提高烟叶品质方面和提高烟农经济效益，促进当地烟草可持续高质量发展等方面提供理论参考。
1.1 试验材料
本试验于2021年1月—7月在湖南省郴州市桂阳烟区进行，土壤类型为水稻土，基础养分指标如下：pH值为5.44，碱解氮含量为72.61 mg·kg-1，有机质含量为33.40 g·kg-1，速效磷含量为14.75 mg·kg-1，速效钾含量为95.14 mg·kg-1。烟草品种为湘烟7号。高碳基土壤修复肥由河南省生物炭工程技术中心研制，河南惠农土质保育研发有限公司加工，主要成分包含生物炭和植物油粕等，高碳基土壤修复肥组成：生物炭含量40.51%，发酵芝麻饼肥含量20.16%。高碳基土壤修复肥养分含量：有机质含量为45.21%，N含量为1.02%，P2O5含量为1.12%，K2O含量为2.90%。
1.2 试验设计
采用随机区组试验设计，共设置2个处理，CK(常规施肥)，T(常规施肥+高碳基土壤修复肥600 kg·hm-2)，每个处理设置3个小区，小区面积为150 m2。常规施肥采用穴施(专用基肥750 kg·hm-2；
提苗肥135 kg·hm-2；
发酵饼肥450 kg·hm-2；
专用追肥750 kg·hm-2；
硫酸钾225 kg·hm-2)。高碳基土壤修复肥采用穴施，施用量为600 kg·hm-2。
栽培管理：按照当地常规生产栽培管理办法进行大田管理，2021年4月施入基肥和移栽烟草幼苗，烟株4月中下旬进入旺长期，5月15日现蕾，5月16日—5月20日进行打顶抹腋芽，6月20日开始采收下部叶，分3次采收，7月15日采收结束，试验地与当地栽培管理一致。
1.3 土壤取样
土壤样品采集于2021年烟叶成熟期，按照五点取样法取烟株根系周围(深度0～25 cm)的土壤，将采集的土壤样品按照四分法混合后分为2份，一部分去除在杂质后，保存在10 mL无菌离心管中，对土壤进行微生物群落检测及酶活性的检测；
另一部分下自然风干(避光)，进行土壤理化性质的测定。
1.4 土壤理化性质及酶活性分析
土壤化学性质测定方法参照文献[14]，土壤酶活性测定方法：蔗糖酶采用DNS比色法，脲酶采用Berthelot法，中性磷酸酶采用磷酸苯二钠法，过氧化氢酶采用紫外吸收法。土壤含水率采用土壤温湿度测量仪(Moisture Meter HH2)测定。
1.5 土壤微生物测定分析方法
土壤细菌测定：采用E.Z.N.A.®soil试剂盒进行土壤DNA提取和PCR扩增，利用超微量分光光度计检测DNA纯度，检测合格后用341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)引物对V3～V4可变区[15]进行PCR扩增，用2%琼脂糖胶回收PCR产物，混合后送IlluminaMiSeq平台进行基因序列测定[16]。
1.6 数据分析
采用Microsoft Excel 2020整理数据，用SPSS 25.0进行t检验，用R语言软件的vegan包绘图。
2.1 高碳基土壤修复肥对土壤理化性质的影响
由表1可以得出，植烟土壤施用高碳基土壤修复肥可以改变植烟土壤特性。从物理特性来看，与CK相比，T处理增加了土壤含水率(24.17%)。从化学性质来看，高碳基土壤修复肥的施加能够增加土壤pH值和养分含量，其中提高了土壤pH值(1.07个单位)、有机质(23.59%)和碱解氮(17.41%)，且到达显著水平。
表1 高碳基土壤修复肥对土壤理化性质的影响Table 1 The effect of high carbon-based soil remediation fertilizer on the physical and chemical properties of soil
2.2 高碳基土壤修复肥对土壤酶活性的影响
由图1可以得出，T处理提高了土壤蔗糖酶活性(97.65%)、中性磷酸酶活性(363.64%)、脲酶活性(356.60%)和过氧化氢酶活性(19.02%)，且达到显著水平。
注：柱上不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。
2.3 高碳基土壤修复肥对土壤细菌群落α多样性的影响
从表2可以得出，T处理提高了细菌的Chao指数、Observed_OTUS指数和Shannon指数，降低了Simpson指数，且均达到显著水平，说明添加高碳基土壤修复肥可以显著增加土壤细菌多样性和丰富度。
表2 高碳基土壤修复肥对土壤细菌群落α多样性的影响Table 2 Effects of high carbon-based soil remediation fertilizers on soil bacterial community α diversity
2.4 高碳基土壤修复肥对土壤细菌群落结构的影响
由图2可以看出，相对丰度前10种的菌门中，T处理相比于CK处理，分别增加了绿湾菌门2.74%的相对丰度、变形菌门1.84%的相对丰度、厚壁菌门2.04%的相对丰度、拟杆菌门5.27%的相对丰度、放线菌门5.43%的相对丰度和奇古菌门2.85%的相对丰度；
降低了芽单胞菌门12.37%的相对丰度、酸杆菌门2.43%的相对丰度、硝化螺旋菌门3.35%的相对丰度和GAL15菌门2.83%的相对丰度。
通过计算细菌门水平上相对丰度的变化倍数(fold chang，FC)来衡量变化的大小，结合P值，筛选出土壤中变化幅度较大菌门。从图3可以得出，T处理相比于CK处理，GAL15菌门、芽单胞菌门和硝化螺旋菌门相对丰度显著降低，且变化倍数高于2，而奇古菌门相对丰度显著性增加，且变化倍数高于2。
图2 高碳基土壤修复肥对土壤细菌门水平上相对丰度的影响Fig.2 Effects of high carbon-based soil remediation
每个点代表一个门水平上细菌类型。横坐标为变化倍数FC，纵坐标为t检验P值。
2.5 土壤细菌群落结构与土壤理化性质相关性分析
由图4可以看出，奇古菌门与含水率(P=0.019)和碱解氮(P=0.049)呈显著正相关关系；
GAL15菌门与含水率(P=-0.042)和碱解氮(P=-0.036)呈显著负相关关系，与速效钾(P=-0.007)和pH值(P=-0.005)呈极显著负相关关系；
芽单胞菌门与速效磷(P=-0.024)和有机质(P=-0.018)呈显著负相关关系；
硝化螺旋菌门与速效磷(P=-0.007)和有机质(P=-0.004)呈极显著负相关关系，与碱解氮(P=-0.049)和pH值(P=-0.041)呈显著负相关关系。
2.6 土壤细菌群落结构与土壤酶活性相关性分析
由图5可以看出，GAL15菌门与蔗糖酶活性(P=-0.004)呈极显著负相关关系；
芽单胞菌门与中性磷酸酶活性(P=-0.039)呈显著负相关关系；
硝化螺旋菌门与中性磷酸酶活性(P=-0.039)和蔗糖酶活性(P=-0.041)呈显著负相关关系；
奇古菌门与中性磷酸酶活性(P=0.039)呈显著正相关关系。
AP:速效磷；
OM：有机质；
SWC：含水率；
AN：碱解氮；
AK：速效钾；
pH：pH值；
*表示P<0.05，**表示P<0.01。
NPH：中性磷酸酶；
INV：蔗糖酶；
CAT：过氧化氢酶；
URE：脲酶；
*表示P<0.05，**表示P<0.01。
2.7 高碳基土壤修复肥对烟叶经济性状的影响
由表3可以得出，施用高碳基土壤修复肥与对照相比经济性状差异显著，主要指标都高于普通对照。从烟叶的均价来看，T处理均价达到25.92元·kg-1，与对照相比提高了7.51%。与对照相比，上等烟比例提高到63.37%，提高12.74%；
在产量产值方面，与对照相比分别提高4.32%和12.15%。综合分析可以看出，施用高碳基土壤修复肥能够显著提升烟叶经济性状，有利于提高烟农经济效益。
表3 高碳基土壤修复肥对烟叶经济性状的影响 Table 3 Effects of high carbon-based soil remediation fertilizers on economic traits of tobacco leaves
3.1 高碳基土壤修复肥对土壤理化性质及酶活性的影响
植烟土壤施加高碳基土壤修复肥后，提高了土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾、pH值和含水率，其中有机质含量、碱解氮含量、pH值和含水率达到显著水平。有研究表明，高碳基土壤修复肥能够有效地提高土壤肥力，生物炭特殊的孔状结构能够有效地降低土壤水分流失，增加土壤含水率[17]。高碳基土壤修复肥本身具有一定的灰分，施用后能够有效提高土壤酸性盐基饱和度，进而降低交换性阳离子含量，提高土壤pH值[18]。常栋等[19]和李文渊[12]等研究结果表明了施加高碳基土壤修复肥可以显著提高土壤有机质含量，这与高碳基土壤修复肥本身是一种富含高碳的有机肥料有关，与前人的研究结果相印证。
植烟土壤施加高碳基土壤修复肥后，显著提高了土壤酶活性。有研究表明，土壤中酶含量主要来自于微生物和动植物[20-21]。在微生物中，细菌在数量和作用中均占有重要的作用。因此，土壤酶活性与细菌必然存在着紧密联系，在细菌与酶活性相关性分析中得以印证。
3.2 土壤细菌多样性及群落结构对高碳基土壤修复肥施用后的响应
植烟土壤施加高碳基土壤修复肥后，提高了细菌Chao指数、Observed_OTUS、Shannon指数，降低了Simpson指数，且达到显著水平；
显著降低了GAL15菌门、芽单胞菌门和硝化螺旋菌门的相对丰度，显著增加了奇古菌门的相对丰度。GAL15菌门与蔗糖酶活性呈极显著负相关关系；
芽单胞菌门与中性磷酸酶活性呈显著负相关关系，与冯慧琳等[22]的研究结果一致；
硝化螺旋菌门与中性磷酸酶活性和蔗糖酶活性呈显著负相关关系；
奇古菌门与中性磷酸酶活性呈显著正相关关系。
硝化螺旋菌门与碱解氮和pH呈显著负相关关系，与前人的研究结果一致[23-26]。这可能是由于它参与亚硝酸盐氧化和氮碳循环所造成的[27]。奇古菌门与含水率和碱解氮呈显著正相关关系，与马晓英等[28]研究结果一致。奇古菌门作为一个丰富的古生菌门，在土壤碳氮循环中具有重要的作用，其中最具特征的成员是化能自养型氨氧化古菌(AOA)。高碳基土壤修复肥可以改变土壤中细菌群落结构并影响其功能，促进土壤养分的利用。
3.3 高碳基土壤修复肥对烟叶经济性状的影响
植烟土壤施用高碳基土壤修复肥后，均价提高了7.51%。与对照相比，上等烟比例提高了12.74%；
产量、产值分别提高了4.32%和12.15%。
综上所述，施加高碳基土壤修复肥可以改善土壤保水及酸化问题，驱动植烟土壤细菌群落结构的改变，进而影响到土壤酶活性，促进烟叶产量、产值的增加。也可为烤烟根际土壤细菌调控、烟草栽培、提高烟叶品质方面和提高烟农经济效益，促进当地烟草可持续高质量发展等方面提供理论参考。
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