李立君 赵婷婷 钱存梦 李淑娴
(南京林业大学，南京，210037)
翟金庭
( 盐城林场)
乌桕(Sapiumsebiferum)又名木子树、蜡树等，是大戟科(Euphorbiaceae)乌桕属落叶乔木，在我国已有1 400多年的栽种历史，是重要的秋色叶树种[1-2]。乌桕叶、根、树皮均可入药，具有抑菌、抗炎、杀虫等作用[3-4]。乌桕种子榨取的固体皮油和液体梓油可制作蜡烛、保护性涂料、生物柴油等[5-6]，是我国亚热带地区重要的工业木本油料树种[7]，是国家林业和草原局重点倡导开发的生物质能源树种之一[1]，具有较高的经济价值。
生产上，乌桕以播种繁殖为主，但该种子具有明显的休眠习性，休眠虽有利于乌桕的系统发育[8-9]，但却给育苗生产带来极大不便。李淑娴等[10]认为，内源抑制物质的存在是导致该种子休眠的重要原因，并且低温层积和赤霉素(GA3)处理有利于打破种子的休眠。关于种子发芽的内源抑制物已有较多研究[11-13]，并且不同种子中不仅内源抑制物质的种类差异较大，而且存在部位也有差异[14-15]。有研究表明，乌桕种子种皮及胚乳中均含有抑制物质，但胚乳提取物的抑制活性显著高于种皮[16-17]。尽管人们对内源抑制物与乌桕种子休眠的关系开展了一些研究，但对造成其休眠的抑制物质的种类的研究较少。为此，本研究以乌桕种子为供试材料，用系统分离法对低温层积不同阶段种子胚乳的甲醇提取液进行分离，并对各分离相进行生物活性测定；
采用气相色谱质谱联用和高效液相色谱技术对胚乳各分离相组分进行分析，筛选种子休眠的内源抑制物，并对这些物质的质量浓度进行动态监测，分析内源抑制物质对乌桕种子萌发的影响。旨在为更好地解除乌桕种子的休眠、促进育苗生产提供参考。
1.1 试验材料
2020年11月份，乌桕(Sapiumsebiferum)种子采集于江苏省南京市情侣园。新采集的种子用质量分数为1%的NaOH溶液浸泡20 min，去除表面白色的蜡质层，种子自然晾干后置于冰箱中4 ℃保存备用。市售白菜矮脚黄(Brassicarapa)种子，纯度≥95.0%，发芽率≥85%。
1.2 低温层积处理过程中乌桕种子发芽能力的测定
将乌桕种子在清水中浸泡一定时间，待其充分吸胀后，将种子与湿润细沙(湿度以手握成团，松开即散为宜)按体积比V(种子)∶V(湿润细沙)为1∶3混匀，置于0～5 ℃层积0(未层积)、40、80、120 d；
定期翻动种子，保持良好的通气条件。随机数取层积不同阶段的乌桕种子50粒，以湿沙作为发芽基质，在培养箱中25 ℃光照培养，进行发芽试验；
以子叶展开、胚根伸长2 cm作为发芽标准，每天统计种子的发芽粒数，当连续3 d每天的发芽率不超过重复粒数的1%时即认为发芽结束，计算发芽率(发芽种子粒数与供试种子总数比值的百分数)；
试验3个重复。发芽结束后，未萌发的种子按国际种子测试协会(ISTA)[18]的要求，采用四唑染色法测定其生活力。
1.3 不同层积时间乌桕种子浸提液生物活性测定
内源抑制物的提取：随机数取各层积时间段的种子100粒，剥除种皮，取出胚乳，称取胚乳5 g。将胚乳粉碎后置于锥形瓶中，再加入50 mL的甲醇溶液(分析纯)，在0～4 ℃密闭浸提，每隔一定时间搅拌1次，使其充分浸提。24 h后，将浸提液置于离心机中，以5 000 r·min-1的转速离心3 min。取上清液，在60 ℃减压浓缩蒸馏，将浓缩液定容至5 mL。再以同样转速离心3 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，所得滤液即浸提液。以上操作重复3次。
抑制物的初步分离：采用系统溶剂法[11-14]对“内源抑制物的提取”中的浸提液进行初步分离，将浸提液分离为5个组分(石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相、水相)。将胚乳各有机相溶液置于旋转蒸发仪(RE-3000)中浓缩蒸馏，最后将4个有机相溶液(石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相)分别用定容瓶定容至100 mL，置于冰箱中4 ℃保存备用。
胚乳各分离相的生物活性测定：将“抑制物的初步分离”中各分离相的提取液进行生物活性测定——在各培养皿中分别加入5 mL提取液，待有机相中的溶剂完全挥发后，再向各培养皿中加入5 mL蒸馏水(水相除外)，并以相同体积蒸馏水作为对照。随机数取白菜种子100粒，3个重复，均匀放在培养皿中，将培养皿置于培养箱中，25 ℃光照培养，进行发芽试验。当子叶展开、胚根伸长1 cm时，认为种子萌发。每8 h统计发芽种子数量，记录发芽需要的时间，发芽时间以d为单位。发芽结束的标准、发芽率计算同上，参考Riis et al.[19]的方法计算发芽指数(Ig)，Ig=∑(Ng/tg)；
tg为发芽时间；
Ng为与tg相对应的时间点正常发芽的种子数。
胚乳各分离相的气相色谱质谱联用仪鉴定：取“抑制物的初步分离”中层积0 d时各有机相的浓缩液150 mL，置于旋转蒸发仪中进行减压浓缩蒸馏，将浓缩得到的物质用相应的有机溶剂溶解定容至3 mL，得到4个有机相提取物的浓缩样品。取浓缩样品，在中国林业科学研究院林产化学工业研究所分析测试中心测试。采用气相色谱质谱联用仪(美国Agelient 6890N/5973N GC-MS)进行内源抑制物的分离鉴定，气相色谱条件——1NNOWAX石英毛细管柱30 m×250 μm×0.25 μm；
柱温50～280 ℃；
升温程序，50 ℃保持2 min，之后5 ℃·min-1升温至280 ℃，保持20 min；
载气为氦气，气化室温度325 ℃。质谱条件——离子源为电子轰击电离源(EI)；
源温200 ℃；
电离电压70 eV；
收集电流300 μA；
发射电流1 mA；
仪器分离率为600。将各分离相萃取液进行气相色谱质谱联用仪分析后，得到各有机相的总离子流色谱图，将总离子进行积分，采用峰面积归一化法，获得各有机物占总质量比例。
1.4 层积过程中乌桕种子部分内源抑制物质量浓度的测定
将“内源抑制物的提取”中低温层积不同阶段的乌桕种子胚乳提取液样品送至清华大学化学分析测试中心进行测试。
采用高效液相色谱仪(美国Agelient HP1100)对层积不同阶段种子胚乳中2,6-二叔丁基对甲酚、邻苯二酚的质量浓度进行动态检测。2,6-二叔丁基对甲酚色谱条件——色谱柱为Discovery C18柱(4.6 mm×250.0 mm×5 μm)，柱温35 ℃；
流动相为甲醇-水(梯度洗脱)，洗脱时间0～7 min时甲醇体积分数为65%、7～13 min时甲醇体积分数为65%～100%、13～25 min时甲醇体积分数为65%，流速为1.0 mL·min-1；
检测波长280 nm，进样量为10 μL。邻苯二酚色谱条件——色谱柱为Discovery C18柱(4.6 mm×250.0 mm×5 μm)，柱温35 ℃；
流动相为甲醇-水(40%甲醇+60%水)，等度洗脱，流速为1.0 mL·min-1；
检测波长280 nm，进样量为10 μL。
采用气相色谱质谱联用仪(美国Agelient 6890N/5973N)对层积不同阶段种子胚乳中棕榈酸、亚油酸的质量分数进行动态检测。两种脂肪酸的气相色谱条件——TR-WAXMS(Thermo Scientific，30 m×250 μm×0.25 μm)石英毛细管柱；
进样口250 ℃，载体为高纯氮气，流量为1 mL·min-1，分流比10。升温程序——80 ℃保持2.5 min，以15 ℃·min-1升温至210 ℃，然后以2 ℃·min-1升至230 ℃，保持10 min。质谱条件——离子源为电子轰击电离源(EI)；
源温230 ℃；
电离电压70 eV；
收集电流300 μA；
发射电流1 mA；
仪器分离率600；
扫描范围的质荷比(m/z)为45～500。
2.1 层积时间对乌桕种子发芽的影响
由表1可见：层积0 d乌桕种子的发芽率为0，但采用四唑染色法发现，这些未萌发种子的生活力为85.0%；
表明绝大部分未萌发种子仍有发芽能力，但因存在休眠而不能顺利萌发。随着层积时间的延长，乌桕种子的发芽率逐渐提高。层积至80 d时，发芽率提高至45.0%，未萌发种子的生活力下降至38.2%，表明此时仍未能彻底解除乌桕种子的休眠。层积至120 d时，发芽率达到89.3%，已显著高于前面几个处理，且此时未萌发种子生活力仅为2.7%，表明种子休眠已全部解除。
表1 层积不同时间乌桕种子的发芽率
2.2 乌桕种子胚乳各分离相对白菜籽发芽的影响
由表2可见：与对照相比，各层积阶段胚乳的石油醚相、乙酸乙酯相、水相提取液，对白菜籽的发芽率和发芽指数均无显著影响，说明这3个相的提取液对白菜籽发芽无抑制作用。而甲醇相、乙醚相的提取液对白菜籽发芽有一定的抑制作用：层积0 d时，甲醇相提取液处理的白菜籽，其发芽率为16.0%、发芽指数为0.7，与对照相比分别下降了82.4%、95.5%；
此时的乙醚相中，白菜籽的发芽率为50.7%、发芽指数为4.4，虽比照也有较大的下降，但与甲醇相相比，分别提高了216.9%、528.6%。层积120 d时，甲醇相的发芽率为72.9%、发芽指数为3.1，比该相层积0 d时的结果分别上升了353.8%、342.8%，但仍比对照下降显著，分别下降了44.1%、71.8%，说明此时甲醇相的提取物对白菜籽发芽的抑制作用减弱，但仍有一定的影响。层积120 d时，乙醚相中白菜籽的发芽率为89.9%，略低于对照，但二者差异不显著，发芽指数为9.6，与对照相比差异显著，说明此时乙醚相的提取物虽对白菜籽发芽率没有影响，但却使白菜籽的发芽速度有所下降。
表2 不同层积时间乌桕种子胚乳各分离相提取液处理的白菜籽发芽率和发芽指数
试验结果说明，随着层积时间的延长，甲醇相和乙醚相的提取液对白菜籽发芽的抑制作用在逐渐减弱。在同一层积阶段，甲醇相对白菜籽发芽的抑制作用较强，乙醚相次之，因此抑制乌桕种子萌发的物质主要存在于甲醇相和乙醚相中。
2.3 层积不同阶段各有机相气相色谱质谱鉴定结果
未层积的乌桕种子胚乳各分离相提取液，经气相质谱鉴定得到总离子流色谱图(见图1)。石油醚相共分离出63个峰，乙醚相共分离出14个峰，乙酸乙酯相共分离出30个峰，甲醇相共分离出52个峰；
通过质谱系统检索并与标准谱图进行比对，将得到的吻合性较好(相似度高于80)的物质列于表3。
a为石油醚相；
b为乙醚相；
c为乙酸乙酯相；
d为甲醇相。
表3 各分离相化合物的种类及占总质量比例
从甲醇相鉴定出的有机化合物共19种，主要为亚油酸、棕榈酸、邻苯二酚，其占总质量比例分别为9.48%、4.18%、2.80%。乙醚相中鉴定出的物质共有9种，主要为2,6-二叔丁基对甲酚、棕榈酸，其占总质量比例分别为65.37%、4.18%。有许多研究表明，酚类化合物是种子中抑制作用较强的物质[16，20-21]，这也是本研究生物测定中甲醇相、乙醚相的抑制作用较强的原因。石油醚相鉴定出的有机化合物有29种，主要为烷类、酯类物质；
乙酸乙酯相鉴定出的有机化合物有12种，主要为酰胺类物质。有研究表明，酰胺类等物质具有一定的发芽抑制作用[22]，但在乌桕胚乳中，它们的占总质量比例较低，这是生物测定中石油醚相、乙酸乙酯相抑制作用较弱的原因。
2.4 解除休眠过程中4种内源抑制物质量浓度的动态变化
已有研究表明，胚乳中2,6-二叔丁基对甲酚、邻苯二酚、亚油酸、棕榈酸4种物质的发芽抑制物质的有效抑制中质量浓度(即半抑制质量浓度)分别为54.8[23]、45.7[12]、915.8[24]、602.6 mg/L[25]。由表4可见：2,6-二叔丁基对甲酚在层积120 d时的质量浓度比层积0 d时下降了68.5%；
虽然质量浓度下降明显，但层积0 d时的质量浓度已经明显低于其半抑制质量浓度。邻苯二酚在层积120 d时的质量浓度比层积0 d时下降了82.6%，且层积0 d时的质量浓度是其半抑制质量浓度的1.3倍，层积120 d时的质量浓度比半抑制质量浓度低77.9%。亚油酸在层积120 d时的质量浓度比层积0 d时下降54.4%，但质量浓度始终高于半抑制质量浓度。棕榈酸在层积120 d时的质量浓度比层积0d时下降了62.0%，层积0 d时的质量浓度是其半抑制质量浓度的1.8倍，层积120 d时的质量浓度比半抑制质量浓度低32.3%。
表4 休眠解除不同阶段的乌桕种子中抑制物质的质量浓度
2.5 休眠解除过程中乌桕种子各项指标相关性
由表5可见：层积时间，与发芽率之间呈显著正相关，与未萌发种子生活力之间呈显著负相关，说明层积能解除种子休眠。层积时间和发芽率，与棕榈酸、2,6-二叔丁基对甲酚、邻苯二酚之间均呈显著负相关，与亚油酸之间无显著相关性；
未萌发种子生活力，与棕榈酸、2,6-二叔丁基对甲酚、邻苯二酚之间呈显著正相关，与亚油酸之间相关不显著。
表5 休眠解除过程中乌桕种子各指标间相关系数
许多种子休眠与内源抑制物质的存在有关[25-26]。以往对种子内源抑制物的研究主要用系统溶剂法和生物测定法，邹雨婷等[27]通过这两种方法研究表明，绿山楂(CrataegusviridisL.)种子中抑制作用最强的是乙醚相，其次是甲醇相；
李庆梅等[28]研究认为，栎属(Quercusspp.)种子中对白菜籽发芽和生长影响较大的是甲醇相、乙酸乙酯相。本研究结果表明，通过低温层积解除种子休眠，在层积120 d时，种子休眠解除；
然后采用上述两种方法提取并分离抑制物，并根据低温层积不同阶段5个分离相的生物活性测定结果，表明对白菜籽发芽抑制作用最强的是甲醇相，其次是乙醚相，且随着层积时间的延长抑制效果逐渐减弱，在试验范围内发芽抑制物质主要存在于甲醇相、乙醚相中。
内源抑制物的种类较多，主要包括有机酸类、酚类、酯类、醛类等[29-30]。已有研究表明种子的休眠性和抑制物含量的变化有关，杨晓玲等[21]研究认为，山楂(C.pinnatifidaBge.)种子休眠的解除与酚类物质含量的下降有关；
郝西等[31]研究认为，花生(Arachishypogaea)种子休眠性强弱，与油酸含量表现为显著的正相关，与亚油酸含量表现为显著的负相关。为探索对乌桕种子萌发有影响的物质种类，本研究采用气相色谱质谱联技术分析未层积种子各分离相的组分和占总质量比例，同时借鉴已有的研究成果，从抑制作用较强的甲醇相、乙醚相中，筛选出占总质量比例较高的2,6-二叔丁基对甲酚、邻苯二酚、亚油酸、棕榈酸4种对乌桕种子萌发有影响的物质，并用高效液相色谱、气相色谱质谱联用技术对休眠解除过程中上述4种物质的质量浓度进行动态监测；
本研究结果表明，层积120 d时2,6-二叔丁基对甲酚、邻苯二酚、亚油酸、棕榈酸的质量浓度比层积0 d时的质量浓度下降幅度较大，分别下降68.5%、82.6%、54.4%、62.0%。虽然亚油酸的质量浓度下降幅度也比较大，但变化规律为“下降-上升-下降”，并且与层积时间、发芽率之间无显著相关性，因此亚油酸对乌桕种子萌发的影响相对较小。棕榈酸、2,6-二叔丁基对甲酚、邻苯二酚，与层积时间、发芽率之间呈显著负相关；
其中邻苯二酚、棕榈酸的质量浓度，在未层积时分别比各自的半抑制质量浓度高27.0%、78.3%，在层积120 d时比各自的半抑制质量浓度又分别低77.9%、32.3%，可见邻苯二酚、棕榈酸的存在是导致乌桕种子休眠的主要原因。2,6-二叔丁基对甲酚的质量浓度在未层积前(36.3 mg/L)已经比其半抑制质量浓度(CI,50，54.8 mg/L)低33.7%，在层积120 d时比其半抑制质量浓度低79.1%。由于未层积前2,6-二叔丁基对甲酚的质量浓度比较低，其对乌桕种子萌发的抑制作用不是特别强，这也是乙醚相对白菜籽发芽的抑制率不高的主要原因。
本研究主要筛选了对乌桕种子的萌发有影响的内源抑制物类别，而内源激素对种子的休眠与萌发也发挥着重要作用[32-33]，但气相色谱质谱联用技术不能鉴定激素类物质，因此今后有必要深入开展内源激素物质对乌桕种子萌发影响的研究。
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