杨和银 魏海燕 田云涛 阿依帕夏·艾沙 姜伶 吐尔逊娜依·艾海提
(喀什地区第一人民医院，新疆 喀什 844000)
心血管疾病是严重威胁人类生命健康的疾病之一，随着患病人群的不断增多，碘造影剂的使用率也逐年增加，同时，由于使用碘造影剂造成的碘造影剂急性肾衰竭患者量也有一定增加〔1〕。临床研究发现，患者碘造影剂肾病主要由急性肾损伤发展而来，在患者接受碘造影剂初期及时发现急性肾损伤并采取有效的干预措施，可有效降低患者进展为慢性肾衰竭的概率，大大提高患者的生活质量和预后〔2〕。急性肾衰竭患者肾小管上皮细胞呈不同程度的急性变性、坏死状态，肾小管扩张，间质水肿〔3〕。前期研究〔3〕结果显示，造影剂所致急性肾损伤组的自噬相关蛋白Beclin-1表达升高，长链非编码RNA(LncRNA)非编码基因(XLOC_036125)和与之空间位置相邻的Lgmn亦表达升高，且 Lgmn与Beclin-1 功能相似，但尚不明确 LncRNA 是否通过Lgmn 调控自噬而影响对比剂所致急性肾损伤(CI-AKI)发生，本研究拟在前期研究基础上从细胞和基因水平，探究CI-AKI中XLOC_036125与Lgmn、Beclin-1的作用关系。
1.1主要试剂 实验用大鼠肾小管上皮细胞HK-2 购于美国模式菌种收集中心(ATCC)。DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购于美国Gibco公司；
CCK8试剂盒购于日本同仁公司；
RIPA裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒、膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)凋亡试剂盒购于美国Invitrogen公司；
兔抗鼠β-actin抗体、鼠抗人Lgmn抗体、鼠抗人 Beclin-1抗体均购于美国Abcam公司；
碘化丙啶(PI)购于中国上海翊圣生物科技有限公司。
1.2实验方法
1.2.1大鼠肾小管细胞 CI-AKI 模型构建 肾小管上皮细胞HK-2 培养于含10%磷酸盐缓冲液(PBS)的DMEM/F12完全培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞长至80%～90%融合时，用0.25%胰酶消化并接种于培养瓶中继续培养。选取对数生长期细胞均匀接种，隔天换液，当细胞处于亚融合状态时换无血清培养基孵育 24 h，添加10 μmol/L顺铂常规孵育 24 h，构建大鼠肾小管细胞 CI-AKI 模型。
1.2.2重组表达质粒构建及质粒提取 LncRNA XLOC_036125及Lgmn稳定过表达重组表达质粒、空载体对照质粒及菌种均委托美国 GeneCopoeia 公司进行构建，LncRNA XLOC_036125-siRNA、Lgmn-siRNA及LncRNA XLOC_036125-siRNA-control、Lgmn-siRNA-control购于广州锐博生物技术有限公司，置于-80℃保存。
质粒提取参照OMEGA公司产品无内毒素质粒中量提取试剂盒操作说明进行，收集菌落培养后形成的菌液，离心，弃上清，依次加入溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行重悬，离心，将上清液转移至新的EP管，加入等体积内毒素吸附(ETR Binding)缓冲液，转移至纯化柱，离心，弃废液，加入内毒素洗涤(ETR Wash)缓冲液，重新离心后加入纯化柱；
加入3-羟基丁酸乙酯(EHB)缓冲液，离心后加入纯化柱；
加入DNA Wash缓冲液，离心清洗；
转移至新EP管，加入无内毒素缓冲液，离心，收集DNA溶液，置于-20℃保存。
1.2.3细胞转染 细胞转染采用lipofectamine 2000试剂盒，LncRNA XLOC_036125及Lgmn稳定过表达重组表达质粒、空载体对照质粒及LncRNA XLOC_036125-siRNA、Lgmn-siRNA、LncRNA XLOC_036125-siRNA-control、Lgmn-siRNA-control分别转染至大鼠肾小管细胞CI-AKI 模型细胞HK-2中,分别为pcDNA3.1-PC-3.1组、pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-PC-3.1组、LncRNA XLOC_036125 siRNA control 组、LncRNA XLOC_036125 siRNA 组、pcDNA3.1-pc-3.1组、pcDNA3.1-Lgmn-pc-3.1 组、Lgmn siRNA NC组、Lgmn siRNA组 。取对数期生长细胞，重选调整浓度，按1.5×105个/孔接种于6孔板中，待细胞生长状态良好达70%～80%融合时进行转染。分别配制a液(240 μl无血清无抗生素培养基+10 μl脂质体)、 b液(240 μl无血清无抗生素培养基+4 μg质粒/100 pmol siRNA)、c液(b液+a液)，充分混匀，室温静置待用。常规细胞换液后，加入1.5 ml无血清无抗生素培养基，均匀滴加c液后，置于细胞培养箱中培养4～6 h，更换完全培养基。
1.2.4RT-qPCR实验 各组细胞总RNA提取采用Trizol法，用紫外分光光度仪测定总RNA浓度与纯度，A260/280在1.8～2.0。按照mRNA反转录试剂盒操作说明进行反转录，参照SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明进行RT-PCR。反应程序：95℃ 30 s预变性，95℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环，收集荧光信号，计算相对定量结果，求出各组细胞中Lgmn、Beclin-1表达水平。
所有试验重复3次，各标本目的基因和管家基因GAPDH的表达量的有关数据记为Ct值，Ct值的含义是指每个反应管内的荧光信号达到所设定的阈值时经历的扩增循环数。以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。Lgmn、Beclin-1引物及管家基因GAPDH引物均由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。
1.2.5Western印迹实验 待各组细胞融合度达90%以上，弃去培养基，用PBS洗涤3次后，使用含有Halt蛋白抑制剂的裂解液，置冰上裂解30 min，收集细胞置于4℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，-80℃保存。使用BCA蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量，根据标准曲线计算蛋白含量。各组以30～60 μg相同的蛋白上样量，煮沸变性后进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳完成后，使用半干转仪转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后用5%脱脂牛奶封闭1 h，随后用1%脱脂牛奶稀释Lgmn、Beclin-1一抗，4℃孵育过夜。次日使用TBST洗脱一抗，再37℃孵育二抗1 h，最后使用化学发光剂进行显影。
1.2.6双荧光素酶报告基因实验 使用TargetScan (http：//www.targetscan.org)和microRNA.org-Targets and Expression (http：//www.microrna.org)数据库预测XLOC_036125和Lgmn结合区域。将Lgmn的XLOC_036125预测靶点序列或突变序列3′-UTR构建于pmirGLO载体。突变序列以正常Lgmn的3′-UTR序列为模板，在与XLOC_036125相结合的预测位点进行点突变。将LncRNA XLOC_036125稳定过表达重组表达质粒、空载体对照质粒及LncRNA XLOC_036125-siRNA、Lgmn-siRNA分别与所构建的载体同时利用DharmFECT Duo试剂进行转染待测细胞，分别为LncRNA XLOC_036125 siRNA control 组、LncRNA XLOC_036125 siRNA 组、Lgmn siRNA NC 组、Lgmn siRNA组，置于培养箱中培养48 h，采用Dual-Glo Luciferase分析系统分析实验结果。具体按双荧光素酶报告基因试剂盒说明书操作。
1.2.7GST-pull down ChIP 实验 将编码蛋白A与GST 的重组质粒化转BL21菌株，挑取单个克隆到含有5 ml LB(+100 μg/ml Amp)的10 ml试管里，37℃培养过夜。将培养菌液转移到含有500 ml LB(+100 μg/ml Amp)的1 L锥形瓶中，37℃，225 r/min培养至OD600 nm 1.0～1.5，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间，3 000 r/min，10 min，4℃离心收集细菌，去尽上清。每500 ml培养液加入10～20 ml细菌裂解液(PBS+1%Triton-100+PMSF)，吹打混匀。冰上超声破碎，开2 s，停9 s，总40～60 min。至裂解液充分清凉。11 000 r/min，15 min，4℃离心分离上清，-80℃保存备用。将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白的真核表达载体上，细胞转染48 h后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融。取50～70 μl GST-Beads到EP管中，用800 μl PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1 h。PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。同时，裂解真核融合蛋白B，吹打收集至1.5 ml EP管，超声破碎。13 000 r/min，15 min，4℃离心取上清。4℃旋转结合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。40 μl 5×上样缓冲液溶解beads上的蛋白，煮沸3 min，高速离心，Run-SDS PAGE做Western印迹检测进行验证。
1.3统计学处理 采用SPSS20.0软件进行两独立样本t检验、近似t检验。
2.1LncRNA XLOC_036125 对Lgmn基因及蛋白表达水平的影响 RT-PCR实验结果显示，与pcDNA3.1-pc-3.1组(1.02±0.02)比较，pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3.1组质粒组HK-2细胞中，Lgmn mRNA 表达水平明显增高(5.74±0.21，P<0.05)，与LncRNA XLOC_036125 siRNA control组(1.09±0.05)比较，LncRNA XLOC_036125 siRNA.1组HK-2细胞中，Lgmn mRNA表达水平则明显降低(0.41±0.02，P<0.05)。Western印迹实验结果显示，与pcDNA3.1-pc-3.1组比较，pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3组HK-2细胞中，Lgmn 蛋白表达水平明显较高(1.02±0.02 vs 2.83±0.17,P<0.05)，与LncRNA XLOC_036125 siRNA control组比较，LncRNA XLOC_036125 siRNA组HK-2细胞中，Lgmn 蛋白表达水平明显较低(1.06±0.03 vs 0.35±0.03，P<0.05)，见图1。
1～4：pcDNA3.1-pc-3.1组、pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3.1组、LncRNA XLOC_036125 siRNA control组、LncRNA XLOC_036125 siRNA组
2.2LncRNA XLOC_036125 和 Lgmn 靶向作用分析 LncRNA XLOC_036125与 Lgmn 3′UTR存在结合位点(图2)。转染野生型Lgmn荧光报告载体的HK-2细胞中，LncRNA XLOC_036125 siRNA组细胞荧光活性明显低于LncRNA XLOC_036125 siRNA control组细胞(0.32±0.04 vs 1.00±0.00,P<0.05)。LncRNA XLOC_036125与 Lgmn存在直接靶向作用关系。
图2 LncRNA XLOC_036125 和 Lgmn 靶向作用分析
2.3Lgmn 蛋白与 Beclin-1 蛋白靶向作用 GST-pull down ChIP 实验结果显示，在HK-2细胞中，与阳性对照组比较，Lgmn 蛋白与 Beclin-1 蛋白存在直接结合的作用关系。见图3。
图3 Lgmn 蛋白与 Beclin-1 蛋白靶向作用
2.4Lgmn 对 Beclin-1 基因及蛋白表达水平的影响 RT-PCR实验结果及Western印迹实验结果显示，与pcDNA3.1-pc-3.1组比较，pcDNA3.1-Lgmn-pc-3.1组HK-2细胞中，Beclin-1 mRNA 及蛋白表达水平均明显增高(P<0.05)，与Lgmn siRNA NC组比较，Lgmn siRNA组HK-2细胞中，Beclin-1 mRNA 及蛋白表达水平则均明显降低(P<0.05)。见表1、图4。
1～4：pcDNA3.1-pc-3.1组、pcDNA3.1-Lgmn-pc-3.1组、Lgmn siRNA NC组、Lgmn siRNA组
表1 Lgmn 对 Beclin-1 基因表达水平的影响
2.5LncRNA XLOC_036125 对 Beclin-1 基因及蛋白表达水平的影响 RT-PCR实验结果显示，与pcDNA3.1-pc-3.1组比较，pcDNA3.1-pc-Lgmn-pc-3.1组HK-2细胞中，Beclin-1 mRNA 表达水平明显增高(1.04±0.03 vs 7.73±0.31,P<0.05)；
与Lgmn siRNA NC组比较，Lgmn siRNA组HK-2细胞中，Beclin-1 mRNA 表达水平则明显降低(1.10±0.05 vs 0.32±0.03,P<0.05)。Western印迹实验结果显示，与pcDNA3.1-pc-3.1组比较，pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-pc-3.1组HK-2细胞中，Beclin-1 蛋白表达水平也明显较高(1.07±0.02 vs 3.42±0.20,P<0.05)；
与LncRNA XLOC_036125 siRNA control组比较，LncRNA XLOC_036125 siRNA组HK-2细胞中，Beclin-1 蛋白表达水平也明显较低(1.12±0.05 vs 0.52±0.07，P<0.05)。见图5。
1～4：pcDNA3.1-PC-3.1组、pcDNA3.1-LncRNA XLOC_036125-PC-3.1组、LncRNA XLOC_036125 siRNA control组、LncRNA XLOC_036125 siRNA组
碘造影剂肾病指碘造影剂在血管内给药48～72 h内出现的无其他原因的不能解释的肾功能损害性疾病，以血清肌酐较基础水平升高25%或绝对值升高≥0.5 mg/dl为诊断标准，其中以急性肾损伤在临床中最为常见〔4〕。心血管疾病介入治疗是目前临床上治疗冠心病的主要技术，尽管碘造影剂工艺发展迅速，但随着接受碘造影剂影像学检查和介入治疗患者数的不断增加，碘造影剂的应用范围越来越广，其带来的碘造影剂急性肾损伤患者总量也逐渐呈现出增多的趋势，其临床干预与治疗也越来越受到关注。有研究比较不同手术引起碘造影剂急性肾损伤患者发生率发现，心脏造影术后患者并发碘造影剂急性肾损伤的发生率明显高于非心脏造影术后患者，合并基础肾脏疾病及肾功能不全患者的发生率则更高〔5，6〕。
有研究发现，碘造影剂急性肾损伤与炎症因子的产生和炎症反应密切相关，炎症是导致碘造影剂急性肾损伤的主要原因之一〔7，8〕。一方面碘造影剂可引起细胞内外液渗透压不同，导致细胞内液向细胞外转移，干扰肾皮质氧化，引起肾小管上皮细胞间质水肿，破坏肾小管上皮细胞完整性，导致细胞骨架发生破坏，最终引起细胞死亡〔9〕，另一方面，碘造影剂还可在一定程度上引起短时间的肾血管扩张及长时间的肾血管收缩，介导舒血管物质分泌减少，进而引起肾髓质发生缺血缺氧，导致肾小管细胞出现损伤，甚至发生坏死〔10，11〕。随着对碘造影剂急性肾损伤发生机制研究的不断深入，近年来不断有研究提升，在碘造影剂急性肾损伤缺血再灌注诱导期间及顺铂等肾毒性药物干预过程中，肾小管近端管状细胞均可诱导自噬的发生〔12〕。自噬诱导是一个低氧应激早期反应，主要发生于管状细胞凋亡之前，在体内外肾缺血-再灌注模型中均可见大鼠近端小管细胞在缺氧条件下诱导产生自噬〔13，14〕。Beclin-1 是酵母自噬基因 6(Ap96/Vps30)在哺乳动物中的同源物，它是自噬重要的正调节因子，其主要通过控制自噬体的形成，调节其他的自噬蛋白定位到前自噬体膜上，控制自噬体的形成，从而调节自噬活性，在自噬起始阶段起重要作用〔15，16〕。本研究结果提示LncRNAs XLOC_036125 调控 Lgmn 与 Beclin-1表达，在一定程度上参与自噬过程的调节，在造影剂急性肾损伤中存在LncRNA XLOC_036125-Lgmn-Beclin-1轴作用。
综上，在造影剂急性肾损伤中，LncRNA XLOC_036125可通过靶向结合Lgmn调控Lgmn及下游Beclin-1表达水平，参与HK-2细胞自噬调控作用。由于急性肾损伤中肾小管细胞自噬发生在凋亡之前，自噬主要是细胞应激和凋亡的早期反应，但此过程中自噬调节的具体作用仍存在争议，LncRNA XLOC_036125-Lgmn-Beclin-1轴参与的自噬调节信号通路尚未完全明了，将在后续研究中深入探索。
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