范朋凯，史利欢，陈静，谢昕，刘俊闪，杨威利
(郑州大学附属儿童医院 a.河南省小儿血液医学重点实验室；
b.河南省小儿神经发育工程研究中心，河南 郑州 450053)
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是疱疹病毒家族中的一员，属于疱疹病毒β亚型，是疱疹病毒属中基因组最大的病毒[1]。HCMV感染后可在人体内长期持续存在，呈潜伏感染状态，免疫功能正常人群多无明显临床症状。免疫力低下人群如新生儿、肿瘤患者、器官移植患者，尤其是免疫系统发育不成熟的胎儿、早产儿、婴幼儿等普遍易感。HCMV可侵袭人体多个器官、系统，引起先天性或围生期疾病，且年龄越小易感性越高[2-3]。机体免疫力下降时，HCMV可在体内大量复制，导致患儿病情加重[4]。免疫系统作为人体抵御感染的重要防御系统，对HCMV具有抵抗、抑制和清除的作用，T细胞免疫在控制HCMV感染方面发挥着巨大作用。在免疫功能正常机体中，HCMV的复制及清除可受到T细胞的有效控制，但在免疫功能低下的机体中，HCMV特异性T细胞的频率及功能减低时，HCMV的复制不受控制，进而导致严重临床症状[5-6]。本研究旨在探讨HCMV感染患儿的实验室指标特点及细胞免疫功能特征，为临床诊疗提供依据。
1.1 一般资料选取2019年1月至2021年12月在郑州大学附属儿童医院确诊的197例HCMV感染患儿，设为病例组。纳入标准：符合2012年《儿童巨细胞病毒性疾病诊断和防治的建议》[7]中的HCMV诊断标准，无免疫系统疾病且尿液聚合酶联反应显示HCMV-DNA拷贝数≥500 mL-1。排除标准：自身免疫病、免疫缺陷病、呼吸道异物、疱疹病毒感染、先天气道畸形、合并先天性心脏病等。选择同时期111例健康体检儿童设为对照组。病例组男133例，女64例，年龄28 d～26个月，平均(3.77±3.54)个月；
对照组男71例，女40例，年龄26 d～28个月，平均(3.52±3.17)个月。两组儿童性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。患儿家属对本研究内容知情，自愿签署知情同意书。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。
1.2 仪器设备及试剂HCMV-DNA检测仪器为罗氏Light Cycler 480 PCR仪，试剂由圣湘生物科技股份有限公司提供。淋巴细胞亚群检测仪器为FACSCanto Ⅱ流式细胞仪，试剂由BD Multitest公司提供。血常规指标检测仪器为全自动血细胞分析仪，试剂由西斯美康公司提供。生化指标检测仪器为贝克曼库尔特UniCel DxC800 Synchron全自动生化仪，试剂由贝克曼库尔特实验系统公司提供。
1.3 检测方法
1.3.1外周血、尿液及母乳标本采集 采集所有研究对象晨起静脉血3管，每管4 mL，分别用于T淋巴细胞亚群、血常规及生化指标检测。用尿杯留取患儿中段晨尿4 mL置于5 mL无菌离心管中。乳汁标本采集：留取患儿母亲母乳4 mL置于5 mL无菌离心管中。
1.3.2尿液、母乳HCMV-DNA检测 PCR-荧光探针法检测尿液HCMV-DNA，取尿液1 mL，12 000 r·min-1离心5 min后，弃上清，加入50 μL核酸释放剂后震荡混匀备用，每个PCR反应管中分别加入待测样本、阳性及阴性对照和定量参考品A～D各10 μL，静置10 min，每管加入PCR-预混液40 μL，吸打混匀3次，盖上管盖，离心(2 000 r·min-1)30 s。严格遵照说明书上机扩增。PCR-荧光探针法检测母乳HCMV-DNA，留取患儿母亲母乳4 mL于5 mL无菌离心管中备用，取1 mL母乳样本于EP管中，12 000 r·min-1离心5 min后，弃上层漂浮物，然后加入800 μL红细胞裂解液，震荡混匀，12 000 r·min-1离心5 min后，弃上清，加入50 μL核酸释放剂震荡混匀备用，后续步骤同上述尿液。
1.3.3T淋巴细胞亚群检测 在每个试管上均做标记，然后将20 μL淋巴亚群检测试剂加到试管底部，再分别吸取50 μL经过充分混匀的抗凝全血加入试管底部，盖上试管轻混匀，在室温(20～25 ℃)下避光孵育15 min，向每个管中分别加入浓度为1×的BD FACS溶血素。盖上试管轻混匀，在室温(20～25 ℃)下避光孵育15 min后上机检测。
1.3.4血常规及相关生化指标检测 均采用全自动仪器检测，分别由专业技术人员将上述留取好的相应血液样本严格按照说明书操作检测完成。
2.1 一般临床指标病例组外周血谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷氨酰转肽酶(glutamyl transpeptidase，GGT)、肌酸激酶同工酶(creatine isoenzyme，CK-MB)、白细胞(white blood cell，WBC)、血小板计数(platelet，PLT)、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和降钙素原(procalcitonin，PCT)水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，但两组Hb水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 两组一般临床指标比较
2.2 细胞免疫功能
2.2.1病例组与对照组细胞免疫功能指标 病例组T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平低于对照组，但CD8+水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 两组免疫功能指标比较
2.2.2母乳HCMV-DNA阳性组与阴性组患儿细胞免疫功能 197例HCMV感染患儿中有83例患儿母亲做了母乳HCMV-DNA检测，其中母乳HCMV-DNA检测阳性50例，阴性33例。两组患儿性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。阳性组和阴性组T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表3 母乳HCMV-DNA阳性组与阴性组患儿细胞免疫功能指标比较
2.3 相关性分析经Pearson相关性分析，HCMV感染患儿HCMV-DNA病毒载量与CD3+水平无相关性(P>0.05)，与CD4+及CD4+/CD8+水平呈负相关(r=-0.142、-0.172，P=0.046、0.016)；
而与CD8+呈正相关(r=0.157，P=0.027)。
HCMV感染在我国普遍存在，其中婴幼儿感染多见[7]。HCMV感染后可引起多组织器官受累，主要临床表现为肺炎和肝功能损害。万雪媛等[8]研究表明HCMV感染肝炎患儿血液系统出现异常。本研究HCMV感染患儿AST、ALT、LDH、GGT、CK-MB、WBC、PLT、CRP、PCT水平均高于健康对照组患儿，提示HCMV感染患儿肝功能、血液系统异常及合并细菌感染。
HCMV是DNA病毒，在人群中广泛存在，呈潜伏感染状态，在宿主免疫功能低下时可呈活动性感染。免疫功能低下群体，如新生儿因母婴传播出现先天感染，也易通过母乳喂养、密切接触病毒携带者或输血等途径于出生后获得性感染[9]。周晋宇等[10]报道在50例母乳喂养婴儿的母亲乳汁中检出了HCMV，但婴儿尿液样未检出。这可能是新生儿的肾浓缩功能尚未发育成熟，但随着婴儿肾浓缩功能发育逐渐健全，尿液HCMV检出率逐渐增高[11]。本研究197例HCMV感染患儿中，有83例为母乳喂养，结果只在50份母乳样本中检出了HCMV，33份母乳样本未检出。这说明婴儿尿液与母亲母乳样本的HCMA-DNA检测结果并不一致。据报道，尿液HCMV-DNA与血清HCMV-IgM抗体联合检测可提高HCMV感染检出率[12]，故在临床工作中必要时可采取联合检测(血清学、组织病理学及pp65抗原)以提高HCMV的检出率。
T细胞免疫在控制HCMV感染方面发挥着重要作用，在免疫功能正常机体中，HCMV的复制及清除可受到T细胞的有效控制，但在免疫功能低下的机体中，当HCMV特异性T细胞的频率及功能减低时，HCMV的复制不受控制，进而导致严重临床症状[5-6]。
多项研究已表明HCMV患儿细胞免疫功能紊乱，李雪茹等[13]报道，97例HCMV感染患儿中，有症状组和无症状组外周血CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平较正常对照组明显降低。万晓春等[14]研究发现HCMV肝炎患儿CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平较非HCMV肝炎患儿低，免疫功能与HCMV肝炎患儿病毒载量有相关性。杨丽娟等[15]报道，HCMV感染可抑制新生儿细胞免疫功能。本研究发现，与对照组相比，HCMV感染患儿的外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平降低，而CD8+水平升高，差异有统计学意义。经Pearson相关性分析发现，HCMV感染患儿HCMV-DNA载量与CD4+及CD4+/CD8+水平呈负相关而与CD8+呈正相关。这说明HCMV感染患儿细胞免疫功能紊乱，HCMV-DNA载量与细胞免疫具有一定相关性。另本研究对83例母乳喂养的HCMV感染患儿的研究发现，母乳HCMV-DNA阳性组及阴性组在外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+上的差异无统计学意义。这提示对于母乳喂养的HCMV感染患儿，母乳中是否携带HCMV可能对患儿的细胞免疫功能无影响。
HCMV病毒可在机体长期存在，其与机体细胞免疫长期争斗。感染初期，机体的自然杀伤细胞产生免疫应答，随后T细胞参与适应性免疫过程，虽然这可在不同时期控制HCMV的复制和增殖，但是HCMV也会削弱机体抗病毒免疫及其他免疫功能，来逃避免疫系统对其监视及限制，从而在体内终身潜伏[16]。CD4+是HCMV感染后的适应性免疫反应的重要效应因子，在机体初次感染后，HCMV特异性CD4+持续存在于机体的T细胞库中，可控制病毒在机体生命周期内的再激活。研究表明HCMV能诱导抗原特异性CD8+克隆增加，HCMV感染能诱导宿主产生大量效应记忆CD8+[17]。虽CD8+能限制HCMV的复制，但不能完全消除或抑制其传播。HCMV特异性免疫应答反应与CD4+/CD8+关系密切，在HCMV感染后CD8+可扩张性升高[18]。HCMV感染和其他慢性病毒感染不同，重复或持续的抗原暴露刺激而引起的一种不典型的CD8+过度增殖，称为记忆膨胀。HCMV感染机体后，T细胞识别病毒抗原表位后进行的增殖性扩张，最主要的是HCMV特异性CD8+数量增多，这种现象在老年人群中更常见，大部分HCMV特异性细胞为CD45RA+效应记忆细胞[19]。
综上所述，HCMV感染的婴幼儿肝功能、血液系统异常及合并细菌感染。外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平降低，而CD8+水平升高，HCMV-DNA载量与细胞免疫功能具有一定相关性。母乳中是否携带HCMV对母乳喂养的HCMV感染患儿的细胞免疫功能可能没有影响。
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