李 明，包鹏云，陶 韦，南海林，徐 哲，曹淑青，姜玉声，马悦欣
（1.大连海洋大学/辽宁省水生生物学重点实验室，辽宁 大连 116023；
2.大连海事大学环境科学与工程学院，辽宁 大连 116026；
3.大连汇新钛设备开发有限公司，辽宁 大连 116039）
刺参（Apostichopus japonicus）又名仿刺参，隶属于棘皮动物门海参纲，是我国重要的海珍品养殖种类，其规模化养殖主要集中在辽宁的大连、盘锦、锦州、葫芦岛等，山东的烟台、青岛等和福建的霞浦等[1]，是我国海水养殖重要支柱产业之一[2]。然而，随着刺参养殖规模的扩大和养殖密度的增加，由病原微生物引起的多种传染性疾病经常发生，给刺参养殖业造成巨大经济损失，已成为该产业健康发展的瓶颈[1,3]。抗生素等化学药物的使用会导致耐药菌的出现[4-5]，抗生素不合理使用会导致渔业养殖环境污染和水产品中药物残留，危害人类健康[6]。因此，环境友好的生物防控方法（如使用益生菌和免疫多糖类等免疫增强剂），越来越多地用于刺参健康养殖和病害防治[1,7]。
学界对益生菌在中国水产养殖业中的应用进行了研究[7]。酵母益生菌可促进鱼[8]、虾[9]和海参[7]的生长、消化酶活力和先天免疫反应。单一酵母菌梅奇酵母（Metschnikowiasp.）C14和仙人掌有孢汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae）C21可提高幼参生长和消化酶活力[10-11]，增强其免疫反应[12-13]。幼参肠道中可培养梅奇酵母C14细胞数量需维持在105cfu·g-1方有提高胰蛋白酶和溶菌酶（LSZ）活力的作用[14]。与添加单一益生菌相比，饲喂添加混合益生菌饲料的幼参特定生长率和消化酶活力更高，免疫反应更强[15-16]。然而，不同菌株组合的混合益生菌对幼参的影响效果不同[15-16]，关于刺参肠道中混合益生菌细胞数量与其有益效果之间的相关性尚未见报道。基于单一酵母菌梅奇酵母C14和仙人掌有孢汉逊酵母C21的有益作用[10-13]，笔者研究二者混合添加对幼参生长、消化酶活力和免疫反应的影响，分析2株酵母菌在幼参肠道内数量与消化酶活力及免疫参数的相关性，为益生酵母菌在刺参养殖中的应用提供参考。
1.1 材料
健康幼参购自大连市某刺参养殖场。基础饲料（固态）配方见文献[12]，具体组分质量分数 (%) 为：豆粕10、鱼粉8、马尾藻25、脱胶海带粉30、麦饭石10、石粉16.5和多维预混料0.5；
营养成分质量分数（%）为粗蛋白16、粗脂肪5.5、粗纤维16和灰分31。
1.2 含菌饲料制备、实验设计及样品采集
从健康刺参肠道分离梅奇酵母C14和仙人掌有孢汉逊酵母C21[12-13]。将C14 和C21 接种至酵母膏胨葡萄糖液体培养基，于25 ℃下振荡培养16 h，将菌悬液离心（4 000 r/min，10 min），用生理盐水重悬，用血细胞计数板计数，添加至基础饲料，分别制备含C14 (1×105g-1)、C21 (1×105g-1)、C14(1×105g-1)+C21(1×105g-1)的饲料。
幼参暂养14 d 后，随机取（0.92±0.01）g 的健康幼参至12 个盛有100 L 过滤海水的塑料桶中，每桶100 头，静水充气饲养。将幼参分为4 组，对照组饲喂基础饲料，实验组分别饲喂添加C14、C21及混合菌（C14+C21）饲料（分别记为M、H 和MH 组），每组设3 个平行。每日16:00 按体质量5%饲喂1 次。M、H 和MH 组幼参饲喂含菌饲料28 d后改饲基础饲料至38 d 实验结束。实验期间水温17～22 ℃，pH 7.8～8.2,盐度33～34。日换水50 L，吸底。
分别在饲养7、14、21、28、29、31、33、35、38 d 时每桶随机取幼参10 头，停饲16 h[17]。用无菌海水冲洗幼参体表，立即剪断尾部，解剖，每头幼参取体腔液50 μL，合并，加入含等体积抗凝剂[18]的离心管，混匀，取400 μL 进行体腔细胞计数，吞噬活力、呼吸爆发测定。其余体腔液离心（10 000 r/min，4 ℃，10 min），得上清液（CF）；
沉淀用体腔细胞等渗液[18]重悬，将重悬液置于冰上超声破碎，离心（10 000 r/min，4℃，10 min），得体腔细胞裂解液上清液（CLS）。制备的CF 和CLS 用于测定LSZ 和总一氧化氮合成酶（T-NOS）活力。
剖取10 头幼参肠道，用无菌海水冲洗后合并，加入9 倍体积预冷生理盐水，匀浆。取部分匀浆液进行酵母菌计数，剩余部分离心（6 000 r/min，4 ℃，10 min），上清液用于消化酶活力测定。
1.3 蛋白质含量的测定
采用考马斯亮蓝法[19]测定体腔液、CLS和肠道匀浆液上清液的可溶性蛋白质含量。
1.4 肠道酵母菌计数
将肠道匀浆液梯度稀释，取100 μL涂布于酵母膏胨葡萄糖琼脂平板，25 ℃下培养7 d，计数。
1.5 幼参生长测定
分别在饲喂前、饲喂7、14、21、28 d 时称量幼参（30 头/桶）体质量，参考文献[10]计算幼参的特定生长率（SGR）。
1.6 消化酶活力测定
使用南京建成科技有限公司试剂盒参照检测方法说明书通过比色分析测定幼参肠道胰蛋白酶和脂肪酶活力[15]。
1.7 免疫参数测定
用血细胞计数板在光镜下计数体腔细胞。根据Ma 等[13]方法测定体腔细胞吞噬活力。体腔细胞呼吸爆发用硝基四氮唑蓝（NBT）还原实验[20]测定，其中测定温度由37 ℃改为室温（约20 ℃）。630 nm处测定溶解细胞质甲臜的光密度（OD），呼吸爆发以每106个细胞的OD 值表示。LSZ 和T-NOS 活力的测定参考文献[14]方法进行。
1.8 数据分析
数据用平均值±标准差表示，用SPSS Version 26 软件进行统计分析。生长、消化酶活力和免疫参数数据进行单因素方差分析。用Levene 法进行方差齐性检验。若满足方差齐性，使用Tukey 法进行事后多重比较；
若方差不齐，差异显著性采用Welch 近似值，并用Tamhane’s T2 法进行事后多重比较。如数据不满足正态分布，则采用非参数Kruskal-Wallis 检验。如P<0.05，则差异显著。采用皮尔逊相关系数分析消化酶活力和免疫参数数据与C14 和C21 细胞数量之间的相关性，显著性采用双尾检验，酵母菌细胞数量使用常用对数转换值。
2.1 幼参肠道中酵母菌C14和C21细胞数量变化
酵母菌C14和C21均可从饲喂含混合菌饲料的幼参肠道分离获得（图1）。幼参肠道酵母菌数量7～28 d 时增加，28 d 时肠道C14 和C21 分别达3.1×105和2.5×105cfu·g-1。仅饲喂基础饲料后（28 d后），肠道中2 株酵母菌数量均下降（图1）。相比之下，饲喂含混合菌饲料的幼参肠道中C14 数量低于饲喂含C14 饲料，C21 数量低于饲喂含C21 饲料，其中21、28、29、31 d 时MH 组幼参肠道酵母菌总数（C14+C21）也低于H 组幼参肠道C21 数量，但高于M 组幼参肠道中C14 数量，不过从M 组幼参肠道只能分离到C14，从H 组幼参肠道只能分离到C21（图1）。
图1 幼参肠道中C14和C21的数量Fig.1 Numbers of C14 and C21 in sea cucumber intestines
2.2 益生酵母菌对幼参生长的影响
养殖14 d 时，MH 组幼参SGR 显著高于对照和H 组（P<0.05）（表1）。养殖21 d 时，M 组幼参SGR 显著高于对照组，养殖28 d 时，M 和H组幼参SGR 显著高于对照组，而饲喂含混合菌饲料21 d 和28 d 幼参SGR 显著高于M 和H 组（P<0.05）（表1）。
表1 益生酵母菌对幼参特定生长率的影响Table 1 Effects of probiotic yeasts on specific growth rates of juvenile sea cucumbers %·d-1
2.3 益生酵母菌对幼参消化酶活力的影响
图2 可见，饲养28 d 时，MH 组幼参胰蛋白酶和脂肪酶活力显著高于对照组、M 和H 组（P<0.05），改饲基础饲料后，29～33 d 时，MH 组与对照组和单一酵母菌组（M 和/或H 组）幼参之间的胰蛋白酶和脂肪酶活力仍有显著差异（P<0.05）。
图2 益生酵母菌对幼参肠道胰蛋白酶和脂肪酶活力的影响Fig.2 Effects of probiotic yeasts on intestinal trypsin and lipase activities of juvenile sea cucumbers
2.4 益生酵母菌对幼参免疫参数的影响
图3(A)可见，MH 组幼参体腔细胞吞噬活力7～28 d 时呈增加趋势，28～35 d 时呈逐渐下降趋势，35～38 d 时趋于平稳。饲养21 d 时，与对照和H组幼参相比，MH 组幼参体腔细胞吞噬活力显著增强（P<0.05）；
饲养28 d 时，MH 组幼参的体腔细胞吞噬活力比对照、M 和H 组更高（P<0.05），M 和H 组平均值略高于对照组，但无显著差异。改饲基础饲料后，29～33 d 时，MH 组幼参体腔细胞吞噬活力与对照组和单一酵母菌组（M 和H 组）间仍存在显著差异（P<0.05）。
图3(B)可见，MH 组幼参体腔细胞呼吸爆发7～28 d 时呈增加趋势，29～35 d 时略有下降，38 d 时下降较明显。饲养28 d 时，与对照组幼参相比，M和H 组幼参体腔细胞呼吸爆发显著增强（P<0.05），而MH 组幼参体腔细胞呼吸爆发显著高于M 和H组（P<0.05）。改饲基础饲料后，29～31 d 时MH组与对照组和单一酵母菌组（M 和H 组）幼参之间体腔细胞呼吸爆发仍存在显著差异（P<0.05）。
图3 益生酵母菌对幼参体腔细胞吞噬活力和呼吸爆发的影响Fig.3 Effects of probiotic yeasts on phagocytic activity and respiratory burst in coelomocytes of juvenile sea cucumbers
图4 可见，MH 组幼参体腔液上清液（CF）LSZ活力7～28 d 时呈逐渐增加趋势，29～35 d 时略有波动，38 d 时下降较明显。饲养14、21 d 时，MH 组幼参CF 的LSZ 活力显著高于对照、M 和H 组（P<0.05）；
与饲喂基础饲料和含C21 饲料幼参相比，饲喂含混合菌饲料28 d 幼参CF 的LSZ 活力显著增加（P<0.05）。MH 组幼参体腔细胞裂解液上清液（CLS）LSZ 活力7～28 d 时呈逐渐上升趋势，28～33 d 时逐渐下降，33～38 d 时略有波动。饲养28 d时，MH 组幼参CLS 的LSZ 活力显著高于对照、M和H 组（P<0.05）。仅饲基础饲料后，MH 组幼参CF（29～35 d）和CLS（29～31 d）的LSZ 活力仍显著高于对照组和单一酵母菌组（M 和H 组）（P<0.05）。
图4 益生酵母菌对幼参体腔液上清液和体腔细胞裂解液上清液溶菌酶活力的影响Fig.4 Effects of probiotic yeasts on lysozyme activity in coelomic fluid supernatant and coelomocyte lysate supernatant of juvenile sea cucumbers
图5可见，MH组幼参体腔液上清液（CF）的T-NOS活力7～28 d时呈逐渐增加趋势，29～33 d时基本平稳，35～38 d时下降较明显。图5(A)可见，28 d时，与对照和H组幼参相比，MH组幼参CF的T-NOS活力更高 (P<0.05)。MH组幼参体腔细胞裂解液上清液（CLS）T-NOS活力7～28 d时呈逐渐上升趋势，29～35 d时缓慢下降，35～38 d时略有波动。图5(B)可见，饲养21 d时，MH组幼参CLS的T-NOS活力显著高于对照、M和H组 (P<0.05)；
与饲喂基础饲料和含C14饲料相比，饲喂含混合菌饲料28 d幼参CLS的T-NOS活力显著提高 (P<0.05)。仅饲基础饲料后，MH组幼参CF (29～31 d) 和CLS（29～33 d）的T-NOS活力仍显著高于对照组和单一酵母菌组（M和H组）(P<0.05)。
图5 益生酵母菌对幼参体腔液上清液和体腔细胞裂解液上清液总一氧化氮合酶活力的影响Fig.5 Effects of probiotic yeasts on total nitric oxide synthase activity in coelomic fluid supernatant and coelomocyte lysate supernatant of juvenile sea cucumbers
皮尔逊相关分析（表2）表明，胰蛋白酶和脂肪酶活力与C14和C21细胞数量间均呈正相关性，所有免疫参数与C14细胞数量间，以及除体腔液上清液（CF）的T-NOS活力外的所测免疫参数与C21细胞数量间显示正相关性。
表2 各参数与C14和C21细胞数量常用对数间的皮尔逊相关性Table 2 Pearson correlation coefficients between each parameter and log10-transformed numbers of C14 or C21 cells
3.1 酵母菌在幼参肠道中的数量变化
本实验中，从饲喂含混合菌饲料幼参的肠道可分离出C14和C21。饲喂含混合菌饲料28 d后，肠道中C14和C21细胞数量达到约105cfu·g-1。然而，当幼参改饲基础饲料后其肠道中2株酵母菌数量10 d内持续下降。这一结果与Macey等[21]饲喂南非鲍（Haliotis midae）含混合益生菌饲料的结果类似。研究结果支持Sharifuzzaman等的通过饲料引入的益生菌在宿主肠道中维持一种短暂状态的观点[22]。另外，本研究中，饲喂含混合菌饲料幼参肠道中C14数量低于饲喂含C14饲料，C21数量低于饲喂含C21饲料的幼参，其原因可能是2株酵母菌在肠道微环境中存在空间或营养上的竞争，这有待进一步研究。
3.2 益生酵母菌对幼参生长及消化酶活力的影响
益生菌促进水生动物生长和促进肠道消化是重要评判指标。本研究表明，饲料中添加单一益生酵母菌C14和C21可显著提高幼参的SGR，与前人研究结果[10-11]一致，且饲喂含混合酵母菌（C14+C21）饲料21、28 d幼参SGR显著高于饲喂含单一酵母菌（C14和C21）饲料，促进生长的一个原因可能是酵母菌富含蛋白质、糖、核酸和维生素等营养物质[16,23-24]。Macey和Coyne[25]报道，饲喂混合益生菌南非鲍肠道蛋白酶活力明显提高，对蛋白质的消化和吸收显著增加，生长速度显著提高。混合益生菌促进生长的另一个原因可能是混合益生菌可提高幼参消化酶活力，从而提高营养物质的消化和吸收。本研究中，饲喂含混合酵母菌（C14+C21）饲料28 d幼参肠道胰蛋白酶和脂肪酶活力显著高于饲喂含单一酵母菌（C14和C21）饲料，与Ma等[16]的饲喂幼参含混合酵母菌饲料的结果类似。本研究显示，幼参改饲基础饲料后3 d内MH组幼参肠道胰蛋白酶和脂肪酶活力仍显著高于单一酵母菌组，且2种酶活力与肠道中C14和C21细胞数量均呈正相关性，但7 d时MH组和单一酵母菌组幼参的2种消化酶活力已无显著差异，可能是2株酵母菌需要在肠道中维持一定的数量方可起到提高幼参消化酶活力的作用，或是前期饲喂酵母菌后消化作用的持续。此外，本研究中幼参生长只测量到饲喂含菌饲料结束，如能统计整个实验阶段幼参的生长情况，应更能全面反映混合益生菌优势。不过，一般生长需要较长一段时间才能体现出来（如开始饲喂7 d各组生长无差异，14 d MH组才和其他组有差异），由于测生长用的是30头幼参，停饲10 d时的幼参数量已不足以测定生长，实验设计时应考虑用更多的幼参。
3.3 益生酵母菌对幼参免疫反应的影响
刺参缺乏特异性免疫器官，主要依赖非特异性免疫防御外来异物，包括体腔液中体腔细胞的细胞免疫和免疫因子的体液免疫。饲料中添加单一海洋酵母菌会影响刺参的先天细胞和体液免疫反应水平，如影响吞噬活力、LSZ和T-NOS活力[13,26-27]以及呼吸爆发[14]。本研究表明，饲料中添加2株酵母菌饲喂28 d可显著提高幼参的吞噬活力、呼吸爆发、LSZ和T-NOS活力，且显著高于单一酵母菌（C14和/或C21）组。这些结果与Ma等[16]饲喂含2株酵母菌 [红酵母H26 (Rhodotorulasp.) +梅奇酵母C14]饲料4周后幼参先天免疫参数变化的结果相似。本研究选择连续饲喂含2株酵母菌饲料28 d，是因为随着连续饲喂时间的推移，28 d时饲喂含2株酵母菌饲料幼参的免疫参数与饲喂单一酵母菌饲料的幼参均呈现出显著差异。饲喂28 d后，将饲喂含酵母菌饲料幼参（单一酵母菌组和2株酵母菌混合组）改饲基础饲料，发现29～31 d（仅饲基础饲料3 d）MH组幼参体腔细胞的吞噬活力和呼吸爆发以及CF和CLS的LSZ和T-NOS活力仍显著高于单一酵母菌组。来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的β-葡聚糖可增强幼参体腔细胞的吞噬活力、呼吸爆发，以及CLS的LSZ、NOS活力[28-29]。本研究中，酵母菌C14和C21可能是通过其细胞壁成分（葡聚糖）激活幼参非特异性免疫反应。应当注意的是，MH组幼参肠道中酵母菌总数（C14+C21）低于H组幼参肠道中的酵母菌C21的数量，皮尔逊相关分析也表明，除C21细胞数量与CF的T-NOS活力无相关性以外，肠道中C14和C21细胞数量与所测免疫参数均呈正相关性，表明幼参免疫水平的提高可能是2株酵母菌在肠道微环境中共同作用的结果。从刺参养殖的角度来看，使用2株酵母菌的混合物可能比使用单一酵母菌更有效，这有待于进一步验证。此外，对照组幼参在实验期间的特定生长率、消化酶活力和免疫反应参数也有一些变化，这可能与刺参自身的代谢和生长及环境因素（如温度）有关。
综上，饲喂C14和C21混合酵母菌28 d对幼参的生长、消化酶活力和先天免疫反应的影响均大于单一酵母菌组，并且仅饲基础饲料后3 d内2株酵母菌仍显著影响其消化酶活力和免疫反应。
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