李共国，何礼涛，孙志栋
（1 浙江万里学院 浙江宁波315100 2 宁波市农业科学研究院 浙江宁波 315040）
芥菜（Brassica juncea）又名苦菜、辣菜、春菜，是十字花科芸薹属芥菜品种[1]。它生长适应性强，产量高，是我国南方地区普遍栽培的腌制加工用蔬菜。它的类型和品种很多，有大叶芥菜、花叶芥菜、瘤柄芥菜、包心芥菜和分蘖芥菜（雪里蕻）等多种芥菜类型。芥菜含有许多天然的植物化学物质[2]，可以预防并抑制多种疾病，传统中医认为芥菜具有一定的食补功效，具有温胃散热以及治疗腹胀气滞、预防便秘的作用[3]。叶用芥菜因有辛辣味，作为新鲜蔬菜的消耗量很小，通常以腌制加工的方式得以保藏。目前，腌制菜大多经脱盐与压榨、调味与装袋、封口与杀菌等热加工工序后流通[4]，加热杀菌会不同程度地破坏食品的质构和营养成分，改变其颜色和口味，导致其品质的劣变[5]。腌制菜非热加工产品的鲜度更好、口感更脆，然而，其在贮藏过程中存在易氧化褐变、细菌数量大的问题，从而影响产品的货架期。一般在腌制蔬菜中添加山梨酸钾、焦亚硫酸钠等食品添加剂或其它食品抑菌剂可抑制微生物生长繁殖。臭氧是一种强氧化性气体，分解后没有残留，对细菌细胞壁的杀灭作用比氯气更强，已被美国食品药品监督管理局（FDA）列入安全绿色保鲜气体，并对多种果蔬有较好的保鲜作用[6]。本文尝试通过正交试验的方法，考察臭氧杀菌，添加防腐剂、抗褐变剂和酸味调节剂等非热加工因素对腌制芥菜贮藏品质的影响，特别关注非热因素影响腌制芥菜细菌总数和亚硝酸盐含量的变化路径，开发一种腌制芥菜的非热加工技术。
1.1 材料与仪器设备
1.1.1 材料与试剂
1.1.1.1 材料 包心芥（酸菜）菜坯，取于宁波某腌制蔬菜厂的周转池。
1.1.1.2 试剂 焦亚硫酸钠，湖南岳阳三湘化工有限公司（食品级）；
柠檬酸，潍坊英轩实业有限公司（食品级）；
山梨酸钾，宁波王龙科技股份有限公司（食品级）；
氯化钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、邻苯二甲酸氢钾、盐酸、酚酞均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 仪器与设备 SW-CJ-2D 双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；
LD2F-50L-Ⅱ立式高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；
H1850R离心机，湘仪离心机仪器有限公司；
ST-756P 紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；
PHS-3CpH计，上海圣科仪器设备有限公司；
YP30002 电子天平，上海佑科仪器有限公司；
臭氧生成器（水中臭氧气体质量浓度可达0.8 mg/L），台州市龙昌农业科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 工艺流程 腌制芥菜加工流程见图1。
图1 加工工艺流程图Fig.1 Processing technology flow chart
1.2.2 正交试验设计 根据对生产酸菜工厂的实地考察，酸菜坯经过清洗、漂淡工艺流程，最后进入O3水杀菌池。根据工厂生产所用的O3杀菌条件，设置本试验的O3水杀菌条件，即0.8 mg/L O3水杀菌时间设置为3，5 min 和7 min。保鲜剂包括防腐剂山梨酸钾、防褐变剂焦亚硫酸钠和酸味调节剂柠檬酸。根据胡秀虹等[7]的研究结果，当山梨酸钾的质量浓度到达0.3 mg/mL 时，对腐败菌的抑制率可达89%；
吴金松等[8]的研究发现，腌制液中添加0.3 mg/mL 的焦亚硫酸钠可以有效延长鲜红辣椒的货架期，并且SO2的残留量符合国家标准；
方子铖等[9]用2.0 mg/mL 的柠檬酸处理竹笋取得较好的护色效果。表1 为四因素三水平的正交试验设计表。
表1 因素水平表L9（34）Table 1 Factors and levels table of L9（34）
1.2.3 样品处理及指标测定 取正交试验各组和对照组芥菜各1 包，各试验组先留出一小部分用于测定芥菜的色泽变化，其余样品用食品匀浆机将其打碎，备用。细菌总数采用平板计数法[10]，将试样经过梯度稀释后在PCA 平板上（37±1）℃培养48 h，肉眼观察记录相应的菌落数量。酸度（总酸含量）采用酸碱滴定法测定，根据酸碱中和的原理，用碱液滴定以酚酞为指示剂，根据碱液的消耗量计算食品中的总酸含量[11]。氨基态氮含量采用甲醛法测定，加入甲醛固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以pH 计测定终点[12]。亚硝酸盐含量采用盐酸奈乙二胺法测定[13]。芥菜的色泽采用色差仪测定，得到的色泽参数为L 值、a 值和b 值，其中L 代表亮度轴，0 表示黑色，100 表示白色；
a 代表红绿轴，正值表示红，负值表示绿；
b 代表黄蓝轴，正值表示黄，负值表示蓝[14]。
1.2.4 综合评分 对总酸含量、氨基态氮含量、亮度L 赋值5 分，数值越大分值越高；
亚硝酸盐含量、菌落总数赋值各5 分，数值越大分值越小，然后给与综合评分。
1.3 数据处理
分别以腌制芥菜细菌总数、亚硝酸盐含量和芥菜亮度为因变量（y），以臭氧杀菌时间（x1）、山梨酸钾含量（x2）、焦亚硫酸钠含量（x3）、总酸含量（x4）、氨基态氮含量（x5）、芥菜亮度L 值（x6）和黄色程度（x7）等为自变量，分析非热加工因素对腌制芥菜贮藏品质的影响。应用DPS 数据处理系统，首先进行多元逐步回归分析[15]；
其次，对进入回归方程的因子，作进一步的通径分析，分析软件直接将自变量与因变量之间的相关系数分解为直接通径系数和间接通径系数。通径系数绝对值大的自变量因子，其对因变量的影响也大，否则对因变量的影响就小[16]。最后，计算各自变量对应变量综合作用的决定系数，如某自变量的决定系数值最大，且为正值，则该自变量成为影响因变量大小的决定因素；
如某自变量的决定系数值最小，且为负值，则该自变量构成影响因变量波动的限制因素[17]。
2.1 高温贮藏试验1 周
2.1.1 正交试验结果与极差分析 芥菜包在37℃贮藏1 周后，正交试验结果与极差分析见表2。所有芥菜贮藏品质指标在各试验号之间均无显著差异。
表2 正交试验结果与极差分析Table 2 Results of orthogonal test and range analysis
从表2 的极差值可见，影响芥菜氨基态氮含量、细菌总数的主要因子均为焦亚硫酸钠含量（C），影响芥菜酸度、亚硝酸盐含量的主要因素均为臭氧杀菌时间（A），影响芥菜亮度和黄色程度的主要因素分别为柠檬酸含量（D）和山梨酸钾含量（B）。综合评分以7 号处理（A3B1C3D2）为最高17.0，其次是5 号处理和9 号处理，6 号处理综合评分最低12.5。
2.1.2 非热加工因素与腌制芥菜细菌总数、亚硝酸盐含量之间的关系 非热加工因素与细菌总数、亚硝酸盐含量之间的逐步多元回归方程见表3（P≤0.0322）。由表3 中决定系数的数值可见，总酸含量是影响酸芥菜细菌总数的决定因素，而氨基态氮含量是影响芥菜细菌总数波动的限制因素。影响腌制芥菜亚硝酸盐含量的决定因素是O3处理，总酸含量是影响芥菜亚硝酸盐含量波动的限制因素。
表3 非热加工因素与芥菜细菌总数、亚硝酸盐含量之间的关系Table 3 Relationships between processing factors and total bacterial count，nitrite content of mustard
为探究加工因子影响芥菜细菌总数和亚硝酸盐含量的机制，作以下通径分析：焦亚硫酸钠影响芥菜细菌总数的直接作用效果最大（表4），作用系数达-1.093（绝对值最大），而其通过氨基态氮对细菌总数产生较大的间接正向作用（作用系数0.525），致使焦亚硫酸钠对芥菜细菌总数的综合作用并非最大，它们之间的相关系数小于总酸含量与细菌总数间的相关系数；
氨基态氮含量对芥菜细菌总数的直接作用系数绝对值仅次于焦亚硫酸钠，为0.742，而其通过焦亚硫酸钠对细菌总数产生的间接负向作用（-0.773）较大，致使氨基态氮含量对芥菜细菌总数的综合作用由正向变为负向，它们之间的相关系数绝对值最小。总酸含量对芥菜细菌总数的综合作用效果最大，由于总酸含量对芥菜细菌总数的决定系数为最大正值（0.409），且与细菌总数之间的偏相关系数【r（y，X总酸含量）=0.9817，P=0.0005】 达到极显著水平。可见，总酸含量是影响细菌总数的决定因素；
氨基态氮含量对细菌总数的决定系数最小，且为负值-0.729，并与细菌总数之间的偏相关系数【r（y，X氨基态氮）】=-0.9864（P <0.01）达到极显著水平。由此，氨基态氮含量是细菌总数变化的限制因素，主要通过焦亚硫酸钠抑菌效应对细菌总数产生较大的间接负向作用。
表4 非热加工因子对芥菜细菌总数的通径分析Table 4 Path analysis of non-thermal processing factors on total bacterial count in mustard
影响芥菜亚硝酸盐含量最大的直接作用因子为O3处理（表5），作用系数（绝对值最大）达-1.075；
其次为总酸，作用系数为-0.600，而总酸通过O3杀菌处理对亚硝酸盐含量产生较大的间接正向作用（作用系数0.921），致使总酸对芥菜亚硝酸盐含量的综合作用由负向变为正向。从相关系数值可见，O3处理对芥菜亚硝酸盐含量的综合作用效果排序第一，总酸含量排序第二。因O3处理对芥菜亚硝酸盐含量的决定系数最大，且为正值0.491，并与亚硝酸盐含量之间的偏相关系数【r（y，XO3处理）】=-0.8482（P<0.05）达到显著水平。因此，O3处理成为芥菜亚硝酸盐含量（下降）的决定因素；
总酸含量对亚硝酸盐含量的决定系数虽最小，也为负值-0.937，但与亚硝酸盐含量之间的偏相关系数【r（y，X总酸含量】=-0.6658（P＞0.05）未达到显著水平，未构成亚硝酸盐含量变化的限制因子。
表5 非热因子对芥菜亚硝酸盐含量的通径分析Table 5 Path analysis of non-thermal processing factors on nitrite content in mustard
2.2 高温贮藏试验2 周
芥菜37 ℃高温贮藏试验2 周后，综合评分也以7 号处理最高21.5，其次是6 号处理和8 号处理，3 号处理的综合评分最低10.0。
非热加工因素（x）与腌制芥菜L 值（y）之间的逐步多元回归方程通过了显著性检验，y=39.80-0.47x1+15.47x2-1.61x4+47.27x5（n=9，r=0.972，P=0.0091）。其中，y 为芥菜L 值；
x1为臭氧处理时间；
x2为山梨酸钾含量；
x4为总酸含量；
x5为氨基态氮含量。影响酸菜L 值的最大直接作用因素为氨基态氮（表6），作用系数达0.824，而其通过山梨酸钾对芥菜L 值产生较大的间接负向作用（作用系数-0.356），致使氨基态氮对芥菜L 值的综合作用并非最大；
O3处理对芥菜L 值的直接作用系数绝对值虽然最小，作用系数为-0.282，而其通过氨基态氮对芥菜L 值产生较大的间接负向作用（作用系数-0.304），致使O3处理对芥菜L 值的综合作用排序第一，它们两者之间的相关系数为-0.557。值得注意的是，山梨酸钾对芥菜L 值的直接作用系数为0.694，而其通过（抑制腐败菌分解芥菜产生）氨基态氮对芥菜L 值产生较大的间接负向作用-0.422，从而使山梨酸钾与芥菜L 值之间的相关系数最小。由于山梨酸钾对芥菜L 值的决定系数最小，且为负值-0.267，并与L 值之间的偏相关系数【r（y，X山梨酸钾）=0.9190，P=0.0098】达到极显著水平。因此，山梨酸钾是影响芥菜L 值变化的限制因素，主要通过（抑菌抑制芥菜降解产生）氨基态氮对芥菜L 值产生较大的间接负向作用。而O3处理对芥菜L 值的决定系数虽为最大正值（0.235），但其与芥菜L 值之间的偏相关系数【r（y，）=-0.7316，P=0.0984】未达到显著水平，不构成影响芥菜L 值的决定因素。另外，酸菜黄色程度与细菌总数（r=0.858，P=0.003）和亚硝酸盐含量（r=0.851，P=0.004）之间均呈极显著的正相关关系，可作为外观品质评价指标。
表6 非热加工因素对酸菜亮度（L 值）的通径分析Table 6 Path analysis of non-thermal processing factors on the brightness（L value）of mustard
一般认为，腌制蔬菜中的乳酸菌是通过产酸达到抑制腐败菌的目的[18]，本试验研究表明，非热加工酸芥菜的细菌总数随着酸度的增大而显著增加（n=9，r=0.687，P=0.041，表4），可见，这里的细菌总数主要是指乳酸菌，乳酸菌产酸使芥菜的酸度增大。氨基态氮含量主要来自芥菜的腐败解体，酸芥菜中的乳酸菌有助于菜体蛋白质降解，使氨基态氮含量升高[19]。王日思等[20]研究发现，焦亚硫酸钠和山梨酸钾对南酸枣皮均有抑菌作用，焦亚硫酸钠不仅可以起到护色作用且抑菌效果要好于山梨酸钾。这是氨基态氮含量对芥菜细菌总数既有较大的直接正向作用系数，又能通过焦亚硫酸钠的抑菌作用对细菌总数产生较大的间接负向作用的缘故（表4）。由于腌制芥菜中的亚硝酸盐产生自腌制过程中细菌分泌的硝酸还原酶对蔬菜中累积的硝酸盐的转化[21]，所以可通过减少细菌总数来降低腌制芥菜亚硝酸盐含量。试验表明，臭氧处理抑制了芥菜亚硝酸盐的产生，提示O3处理是促使芥菜亚硝酸盐含量下降的最大直接作用因子（表5），而总酸含量可通过O3杀菌处理（减少乳酸菌）间接促进了亚硝酸盐含量的上升，这是因为乳酸菌有抑制亚硝酸盐产生的作用[19]。综上，O3对酸芥菜杀菌处理不宜过度。
贮藏后期，芥菜随着不断被降解产生氨基态氮，芥菜中的色素物质也会发生变化，其中叶绿素和花青素不稳定、易褪色，而胡萝卜素和叶黄素在贮藏过程中比较稳定、不易变色，使蔬菜的外观变黄[22]，这使腌制芥菜的色泽变得淡而白，并使氨基态氮含量成为影响芥菜L 值最大的直接作用因子（表6）。然而，山梨酸钾可通过抑菌抑制芥菜的降解，阻断色素的分解，减缓腌制芥菜颜色变淡的进程。另外，山梨酸钾还有保持腌制芥菜黄色程度的作用（表2）。
高温贮藏试验1 周后，总酸含量是酸芥菜（乳酸菌）细菌总数的决定因素，氨基态氮含量是影响细菌总数变化的限制因素，主要通过焦亚硫酸钠抑菌效应对细菌总数产生较大的间接负向作用。O3处理是酸芥菜亚硝酸盐含量下降的决定因素。高温试验2 周后，山梨酸钾是芥菜L 值变化的限制因素，主要通过抑菌抑制芥菜的色素分解对芥菜L 值产生较大的间接负向作用。酸菜细菌总数和亚硝酸盐含量随着酸菜黄色程度的加深而极显著增大，外观品质黄色程度可作为酸菜品质评价的指标。综合第1 周、第2 周贮藏试验的酸菜品质评分，处理7 号A3B1C3D2（0.8 mg/L O3臭氧处理3 min，焦亚硫酸钠含量0.3 mg/mL 和柠檬酸含量1.0 mg/mL）为酸芥菜非热加工最佳工艺。
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