姚经经 黄晗丹 喻锦铃 高 颖 张惠利 刘志辉
牙髓病是口腔疾病中发病率较高的一类疾病，主要包括可复性牙髓炎、不可复性牙髓炎和牙髓坏死。牙髓是位于牙髓腔内的富含细胞、神经和血管的疏松结缔组织，具有形成、营养、感觉和防御的功能[1]。当细菌感染、物理或化学刺激导致牙髓组织发生炎症反应、坏死甚至进一步累及根尖区组织时，牙髓便丧失了生理功能，并出现剧烈疼痛、牙根发育停止、根尖区骨吸收等临床症状，最终造成牙齿的缺失。如何有效地促进受损牙髓的恢复和功能性牙髓的再生成为牙髓治疗的热点和难点。
浓缩生长因子（concentrated growth factor,CGF）是从自体血液中提取的最新一代血小板浓缩物，有良好的生物相容性和生物安全性，多孔的纤维蛋白网络中镶嵌着丰富的生长因子和细胞成分，是一种理想的生物支架和生长因子储存库，广泛用于骨、神经、血管、肌肉、上皮等组织的修复和再生[2，3]。近年来，大量研究发现CGF在牙髓治疗中具有重要作用。本文就CGF的生物学特性及其在牙髓病不同发展阶段中的作用和机制进行综述。
CGF是将血液样品变速离心后获得的淡黄色、不透明且富有弹性的纤维蛋白凝胶，在肉眼下类似于富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF），但其拉伸强度更高；
与PRF相比，电镜下CGF的纤维蛋白有着更规则、致密的网络结构，生长因子和细胞成分也更稳定，同时具有良好的粘附性[4]。致密的纤维蛋白网络不仅为嵌入内部的细胞和生长因子提供保护，使其释放接近生理模式，并且还为细胞迁移和增殖提供三维空间和机械支持[5]。变速离心增加了血小板碰撞几率，激活后释放出大量生长因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-basic,FGF-2）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）等[3]，调控细胞增殖、分化和胶原合成，抑制炎症反应[6]，是CGF发挥作用的基础。CGF中的细胞成分主要包括血小板、红细胞、成纤维细胞样细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞，可以产生细胞因子并调节其释放，同时发挥抗炎和免疫调节作用[7]。最新的研究发现CGF中可能还含有内皮祖细胞[8]和多能干细胞[3]，具有良好的分化能力，参与血管和骨组织的形成。因此，CGF中的纤维蛋白网络、生长因子和细胞成分三者协同作用，在组织修复和再生中有巨大的应用潜力。
当牙髓病变局限或可逆时，通常选用盖髓术和牙髓切断术，将盖髓剂置于近髓牙本质或露髓口，发挥抗菌活性的同时，刺激牙本质中的生物活性分子释放，驱动第三期牙本质形成，以修复受损牙髓并保存正常牙髓组织[1]。但临床上常用的盖髓材料如氢氧化钙、三氧化矿物凝聚体（mineral trioxide aggregate,MTA），存在着细胞毒性、牙本质桥形成缺陷、材料溶解和牙冠变色等缺点，因此有必要寻找一种更加安全、高效的新型盖髓材料，最大限度地保留牙髓活力。
1.体外研究
CGF可以释放多种生长因子，创造一种修复微环境，是潜在的盖髓材料。其中发挥作用的生长因子主要有TGF-β1、VEGF、骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic proteins,BMP-7），调节炎症反应，刺激牙源性干细胞增殖及成牙本质向分化，诱导牙髓牙本质复合体的形成[9]。Tian等[10]发现，CGF在体外可以促进牙髓细胞粘附、增殖和迁移，上调牙髓细胞的成牙本质向分化标志物水平,并通过骨形态发生蛋 白-2（bone morphogenetic proteins,BMP-2）/Smad5信号通路促进牙髓细胞的矿化。Dou等[11]将人牙髓细胞与CGF、氢氧化钙、MTA、i Root BP plus等传统盖髓材料浸提液分别共培养后，显示氢氧化钙抑制牙髓细胞的增殖并促进其坏死和凋亡，有一定的细胞毒性，而CGF、MTA和i Root BP plus对牙髓细胞的迁移和矿化具有相似的促进作用，且CGF对牙髓细胞的促增殖作用更为显著。进一步研究发现，与MTA[12]或者i Root BP plus[13]相比，CGF能调控人牙髓细胞的细胞周期，增加S期细胞百分比，减少细胞凋亡，显著增加碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白、骨钙蛋白等成骨/成牙相关基因表达水平，更有利于牙髓牙本质复合体的形成。
2.体内研究
在体内实验中，有学者将CGF、MTA和氢氧化钙分别置于比格犬机械露髓的牙髓表面，3个月后各组牙髓断面均形成了牙本质桥，髓腔变窄，根管内牙本质层增厚，MTA和氢氧化钙组的牙髓组织中纤维增生、充血，成牙本质细胞消失，但CGF组的牙髓样组织周围可见排列规则的成牙本质细胞和前期牙本质的形成[10]，提示CGF有利于牙髓牙本质复合体的再生。CGF用于活髓保存的临床研究较少，但有系统评价[14,15]显示，PRF等血小板浓缩物与MTA、氢氧化钙在人体内具有相似的盖髓效果，成功率达88%～100%，临床表现和影像学检查均未见明显异常。综上所述，CGF用于活髓保存的体内研究和临床研究数量少，且各个实验的异质性高，难以进行统计学分析，需要大量的动物研究明确其在活髓保存治疗中的作用效果，为临床应用奠定基础。
当牙髓病变是不可逆或无法修复时，临床上通常选用根管治疗，但根管治疗后的牙齿由于缺少血管、神经的滋养，牙体组织变脆，易折裂，且无感觉功能，而再生性牙髓治疗旨在通过组织工程学原理，生成新的牙髓样组织，恢复牙齿的生理功能，成为一种新的治疗选择。再生性牙髓治疗的方法主要包括牙髓血运重建术、细胞移植技术和细胞归巢技术。牙髓血运重建术是目前唯一用于临床的牙髓再生技术，但再生组织为骨样和牙周样组织，并非真正意义上的牙髓再生[16]；
细胞移植技术需要遵循复杂的干细胞选择、扩增、储存、运输等程序，存在病原体传播和免疫排斥的风险，临床应用较为困难；
而细胞归巢技术是利用生物信号分子使内源性干细胞迁移、增殖和分化，可规避上述风险，易操作和实现临床转化[17]。
1.体外研究
CGF作为一种富含生长因子的天然支架，主要通过细胞归巢的策略实现牙髓组织的再生。FGF-2是牙髓再生治疗中研究最多的生长因子，已被证明参与牙髓组织修复和再生的所有阶段，包括牙源性干细胞的迁移、增殖、细胞干性的维持以及血管和神经形成，其中FGF-2通过BMP和Wnt信号通路调节牙源性干细胞的成牙本质向分化；
通过刺激血管内皮细胞增殖及增强牙髓干细胞的特性以促进新生血管的形成；
FGF-2不仅是一种重要的神经营养因子，还诱导牙髓干细胞分化为神经元细胞，有利于神经的修复和再生[18]。
促进牙髓再生的干细胞主要有牙髓干细胞和根尖乳头干细胞[19]。Jin[20]等用不同浓度（5%、10%、20%、50%和80%）的CGF条件培养基培养牙髓干细胞，发现CGF促进牙髓干细胞增殖且成剂量依赖性，但是较低浓度（10%和20%）的CGF对牙髓干细胞的迁移和矿化作用更为明显，原因可能为高浓度的CGF中含有较多的炎症因子从而产生了负性作用。Xu[21]等用脂多糖和CGF条件培养基共同培养牙髓干细胞，与对照组相比，CGF对炎症状态下的牙髓干细胞仍具有显著的促增殖和迁移作用，并上调牙本质基质蛋白1、骨钙蛋白等成牙/成骨相关基因水平，为临床上牙髓炎症时CGF的应用提供了理论支持。与牙髓干细胞相似，CGF对根尖乳头干细胞的增殖、迁移同样具有明显的促进作用，上调碱性磷酸酶、牙本质基质蛋白1等基因的表达[22，23]，提示当牙髓完全坏死缺乏牙髓干细胞时，CGF作用于根尖乳头干细胞发挥功能。
改善局部缺血微环境和促进神经形成是再生性牙髓治疗的关键环节。CGF中富含VEGF、基质金属蛋白酶等必要促血管生成因子和内皮祖细胞样细胞，有利于多种血管生成介质的表达，增加毛细血管通透性，诱导内皮细胞迁移、增殖和小管样结构的形成[8，19]。分别用含有CGF和VEGF的内皮细胞诱导培养基培养牙髓干细胞7天后，与二者单独应用相比，CGF和VEGF联合应用产生协同作用，形成了更为广泛、成熟的小管样结构[20]。Qin[24]等用CGF条件培养基培养雪旺细胞，发现其神经生长因子和胶质细胞源神经营养因子的基因和蛋白表达水平均提高约1.5倍，极大地促进了周围神经的功能性修复。因此，CGF不仅对牙源性干细胞具有趋化、增殖和成牙本质向分化的作用，还可以促进血管和神经的形成，为CGF在牙髓再生治疗的体内研究提供了理论基础。
2.体内研究
Xu[21]等将比格犬未成熟前牙摘除牙髓后，CGF导入根管，严密封闭，8周后拔除患牙，可见根管壁增厚，根尖正常闭合，根管内新形成的牙髓样组织不仅高表达VEGF和巢蛋白，其周围还伴有栅栏状排列的类成牙本质细胞，提示功能性牙髓再生的可能。而Zhang[25]等将CGF和血凝块分别导入人离体牙根管后，植于裸鼠皮下，结果显示二者诱导的新生组织结构类似，CGF组的神经纤维和血管数量更多，差异有统计学意义，但均未发现类成牙本质细胞及新生牙本质，原因可能为皮下组织的微环境不利于牙本质的形成。CGF能否再生功能性牙髓组织尚存争议，需要更多高质量的动物研究予以证明。
3.临床研究
Wang[26]等报道了一例CGF用于年轻恒牙牙髓再生的临床研究，彻底消除根管内感染后，将CGF凝胶剪碎置于根管全段，然后用MTA严密封闭根管口，术后10个月根尖孔闭合，根尖区大面积暗影消失，但牙髓活力温度测试无反应。最新的一项回顾性研究[27]总结了CGF和血凝块用于因外伤导致牙髓坏死的年轻恒牙的牙髓再生治疗，以牙根是否进一步发育作为评判成功或失败的标准，结果显示80.6%的牙齿发生了牙根的进一步发育，其中血凝块成功率明显高于CGF，牙齿撕脱性损伤的成功率最低，仅为33.3%，提示不同原因导致的牙髓坏死会影响牙髓再生的效果，不同血小板浓缩物的作用效果也存在差异。目前CGF用于牙髓再生的临床研究大多为年轻恒牙的病例报道，大部分病例都有牙根的进一步发育，但未见牙髓活力恢复的报道。
当牙髓病变继续发展累及根尖区时，若长时间未得到控制则会进展成根尖周炎或根尖周囊肿等疾病，损伤根尖区牙骨质、牙周膜和牙槽骨，进而造成大面积的骨缺损。临床上常需辅以根尖手术治疗，彻底清除感染，单独或联合填塞骨粉和CGF等血小板浓缩物，以加快根尖区骨缺损的修复和提升骨再生的质量。
1.体外研究
根尖区结构复杂，CGF可以作用于多种根尖区细胞实现骨组织的修复，发挥作用的生长因子主要有TGF-β1、BMP-2、VEGF[28]，已报道的细胞包括成骨细胞[29]、骨髓基质干细胞[30]、牙髓干细胞[21]、根尖乳头干细胞[22]、牙周膜成纤维细胞[31]、牙周膜细胞[32]等。Dong[29]等发现CGF不仅可以促进成骨细胞的增殖和迁移，还通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信号通路，增加成骨细胞的矿化。Qiao[32]等将不同浓度（1CGF、3CGF、5CGF）的CGF处理牙周膜细胞，TGF-β1和血小板衍生生长因子-AB（platelet derived growth factor,PDGFAB）处理作为阳性对照组，结果发现取自3 ml全血的CGF，即3CGF组中牙周膜细胞的增殖、碱性磷酸酶活性和Wnt3a基因的表达均明显高于其他实验组和阳性对照组，表明CGF中多种活性成分协同作用，且3CGF成骨作用最为突出。有学者[3]将CGF中提取的原代细胞成骨诱导21天后，茜素红染色显示强阳性，矮小相关转录因子2、骨钙蛋白等成骨标志物的表达增强7~11倍。以上研究表明CGF不仅可以促进多种根尖周细胞成骨分化，CGF中的原代细胞也具有强大的成骨潜力。另一方面，控制炎症反应也是根尖周骨修复的重要环节。最近的一项研究[33]发现，CGF可以促进单核细胞迁移，诱导其成熟分化为巨噬细胞，并激活PKB信号通路促进M2型巨噬细胞极化，调节机体免疫应答和炎症反应，为炎症状态下组织的修复创造一个有利微环境。
2.体内研究
CGF作为最新一代的血小板浓缩物，Li[34]等比较了CGF与PRF、贫血小板血浆（platelet-poor plasma,PPP）对新西兰兔拔牙后骨再生的作用效果，发现CGF组牙槽骨的吸收明显减少，差异有统计学意义，且新生骨小梁比其他组粗大、排列紧密，提示相比于其他血小板浓缩物，CGF有着更加优异的骨诱导和骨再生能力。有学者将CGF与纳米羟基磷灰石/胶原蛋白支架联合或单独植于兔下颌骨缺损区，结果显示二者联合应用时新骨生成速度和生成量明显大于单独应用，新生骨组织在组织学和影像学表现与正常骨组织相似，且有良好的抗压强度和弹性模量，复合材料在24周时几乎完全降解，表明CGF与骨修复材料联合应用可以获得较为理想的骨修复效果[35]。
3.临床研究
由于CGF优异的成骨作用，其在根尖周炎骨修复治疗的临床研究中受到越来越多的青睐。Sureshbabu等[36]报道了患有慢性根尖周炎的4颗前牙行根尖手术后，在根尖骨缺损处放置CGF纤维蛋白块，并覆盖CGF膜，6个月后即形成了理想的骨愈合，明显缩短了广泛性根尖周病变愈合的时间。Jiang[37]等比较了CGF联合根尖刮治术和单一行根尖刮治术治疗慢性窦道型根尖周炎的临床疗效，发现用CGF覆盖根尖区创面的患牙，其牙槽骨密度明显增高，根尖新骨形成量较多，临床有效率达95%，明显高于未使用CGF组。当根尖周炎比较严重，需要拔除患牙时，CGF仍具有应用价值。Keranmu[38]等将CGF置于因根尖周炎而微创拔除的磨牙牙槽窝底部，然后将第三磨牙移植于牙槽窝，随访发现CGF组显著减轻了术后疼痛和初期愈合的反应，缩短愈合周期，2年后患者根尖周病变完全愈合，咀嚼功能正常，临床检查和影像学检查均未见异常，移植成功率高达100%。综上，CGF在根尖周炎骨修复治疗中具有良好的临床效果。
CGF来源丰富，制取方便，生物相容性和生物安全性高，免疫原性低，多种生物活性成分协同作用，在活髓保存、牙髓再生、根尖周炎骨再生中已被证明具有良好的潜能，但仍具有一定的局限性。首先，单纯CGF释放生长因子过快，局部生长因子浓度过低，无法作用于组织修复的全程，特别是修复时间较长的骨组织工程。其次，CGF发挥作用的机制尚未明确，各种生长因子之间相互作用复杂，再生的组织是否具有生物学功能也存在争议。最后，CGF中活性成分是否会对全身其他细胞产生作用未见报道，不同患者的内源性干细胞活力差异较大，CGF的适用条件及适宜浓度也需要考虑。因此，未来的研究应着重于CGF局部生长因子缓释系统的构建，并使其在特定部位可以精准调控生长因子的释放顺序和释放剂量，满足不同阶段组织修复和再生的需求。虽然目前尚未实现真正意义上的牙髓再生，但不可否认的是生长因子是牙髓再生的关键，CGF作为生长因子储存库和天然支架，在牙髓治疗中有着巨大的应用潜力，应进行更深层次的基础研究和大量的随机对照体内及临床实验，为CGF的临床应用提供更高质量科学证据，加快再生牙髓病学的发展。
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