吕琼芳，彭敏，梁惠明，曾志坚，黄少宏，杜瓦
（江门市药品检验所，广东 江门 529000）
抗感染类药物如四环素类、喹诺酮类、磺胺类、林可酰胺类等属于天然或人工合成的抗菌药物，具有抗菌和消炎的作用.抗菌药物属于处方药物，必须在医生指导下方可使用，但往往会有一些化妆品不法商家为追求经济利益，不顾消费者的健康安全，常在祛痘[1-2]、除螨、止痒类化妆品中非法添加[3-4].虽然短期内效果立竿见影，但长期使用添加抗菌药物的化妆品，可能引起接触性皮炎如红斑、水肿、糜烂、脱屑、瘙痒等不良反应，抗菌药物里面的氯霉素还会导致白细胞减少、抑制骨髓生成、损害肝肾等危害[5]，而且在消费者不知情的情况下长期使用添加有感染药物的化妆品容易造成细菌耐药性增强，使得药效降低而延误治疗，导致严重的社会问题，因此我国《化妆品安全技术规范》（2015 年版）[6]中明确规定抗感染类药物为化妆品禁用成分.
化妆品中禁用物质的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、液质联用法等，超高效液相色谱串联质谱技术是将超高效液相的高效分离能力与质谱的高灵敏度和极强专属性结合起来的分离检测技术.因其具有分离能力强、灵敏度高、分析速度快和自动化程度高等特点，近年在化妆品的多组分分析、微量组分的确证及定量方面成为主流技术[7-9]，应用范围十分广泛.
本文在《化妆品安全技术规范》（2015 年版）纳入的化妆品中抗感染类药物的检测方法的基础上，结合实验室检验工作实际，进行方法优化，采用UPLC-MS/MS 液质联用技术检测化妆品中36种抗感染类药物，以期快速、准确、高效筛查化妆品中抗感染类药物的非法添加，为化妆品的质量监管提供有效的技术支撑.
1.1 仪器与试剂
ACQUITY UPLC H-Class Plus XEVO TQ-S micro 超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪（美国Waters 公司）；
METTLER XS205DU 电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；
Vortex3000 涡旋振荡器（德国WIGGENS 公司）；
KQ-700DA 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
CT15RT 高速冷冻离心机（上海天美生化仪器设备工程有限公司）；
Milli-Q 纯水仪（美国Sartorius 公司）.
138 批次样品通过商超、母婴店、批发市场及网络等途径购买.36 种抗感染药物名称见表1.
表1 36 种抗感染类药物
标准品来源：磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、莫西沙星、盐酸呋喃它酮、金霉素盐酸盐均来源CATO，依诺沙星、盐酸沙拉沙星、氧氟沙星、盐酸双氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、克霉唑来源OST，余下来源中国食品药品检定研究院；
乙酸铵（质谱级，SIGMA）、甲醇（色谱纯，MERCK）、乙腈（质谱纯，MERCK）、甲酸（质谱级）；
实验用水符合GB/T 6682—2008一级水要求.
1.2 试验方法
1.2.1 仪器条件
色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱.
流动相：流动相A 为5 mmol 乙酸铵缓冲液（pH 4.0），流动相B 为乙腈（含0.1%甲酸）；
梯度洗脱程序见表2，进样量2 μL；
柱温40 ℃；
流速0.4 mL/min；
样品控温：10 ℃.
表2 流动相的梯度洗脱程序
质谱条件：离子源ESI 源；
离子化模式ESI+和ESI-；
扫描模式MRM 多反应监测模式.正、负离子模式参数设置：毛细管电压0.5 kV，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度500 ℃，脱溶剂气流速1 000 L/h，锥孔气流量（氮气）50 L/h.1～2 min不进入质谱仪分析，2～2 3 min 进入质谱仪分析.
1.2.2 混合标准储备溶液的制备
氯霉素、克林霉素磷酸酯标准储备溶液：精确称取氯霉素、克林霉素磷酸酯标准品各10 mg，分别置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇充分溶解并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为1.0 mg/mL 的储备溶液.
其他组分标准储备溶液：分别精确称取表1 中余下组分标准品各10 mg，分别置100 mL 棕色容量瓶中，加入甲醇充分溶解，部分溶解性差的标准品可先加入少量甲酸或水以促溶解，再用甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.1 mg/mL 的储备溶液.
混合标准储备溶液：精确移取36 种待测组分的标准储备溶液各1.0 mL 于100 mL 容量中，用甲醇稀释至刻度，作为混合标准储备液.
1.2.3 样品处理
称取样品0.2 g，置于15 mL 离心管中，加入饱和氯化钠溶液3 mL，涡旋30 s，使其分散均匀，再加入0.5%甲酸乙腈溶液5 mL，涡旋30 s 后超声30 min，再次涡旋混合均匀后以10 000 r/min 转速0 ℃冷冻离心10 min，吸取上清液于10 mL 容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，摇匀，经0.22 μm滤膜过滤后，滤液作为供试品溶液.其中1 批次酮康唑阳性样品按上述步骤处理后定容至10 mL 容量瓶，精密吸取5 mL 至200 mL 容量瓶中（稀释40 倍至标准曲线线性范围），用初始流动相稀释定容至刻度，稀释液经0.22 μm 滤膜过滤后测试.
1.2.4 系列基质标准溶液的制备
取5 份与待测化妆品配方相同或相近的基质空白样品，每份0.2 g，置于15 mL 离心管中，依次加入混合标准储备溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按照样品处理操作步骤同步处理，配制质量浓度分别为200、400、600、800、1000 ng/mL 的氯霉素、克林霉素磷酸酯系列溶液，其余组分分别配制质量浓度为20、40、60、80、100 ng/mL 的系列溶液.
2.1 组分定位
图1 为36 种抗感染药物标准品色谱图.其中磺胺甲二唑（通道5）、多西环素（通道26）、阿奇霉素（通道34）均出现2 个峰，反映磺胺甲噁唑、四环素、克拉霉素标准品存在离子交叉或相近的情况，经单标定位确定通道5 前峰为磺胺甲二唑，通道26 后峰为多西环素，通道34 前峰为阿奇霉素.
图1 36 种抗感染药物标准品色谱图
2.2 标准品溶解问题
因大部分沙星类标准品不易溶于甲醇，需加入少量甲酸或水促进溶解后再用甲醇定容.
2.3 样品前处理优化
1）采用标准中的8 000 r/min 转速0 ℃冷冻离心5 min，部分基质样品分层不明显，吸取上清液时容易损失，造成结果不准确.改用10 000 r/min 转速0 ℃冷冻离心10 min，加大离心转速并延长离心时间，各种基质样品分层均明显.
2）饱和氯化钠与0.5%甲酸乙腈溶液不互溶，离心后取出需立即吸净上清乙腈层，吸管用初始流动相清洗后洗液并入，改用初始流动相定容，峰形和响应比用水定容更好.定容时易产生泡沫，可静置一段时间消泡后再定容，结果更准确.
2.4 色谱条件优化
1）进样量：采用标准5 μL 进样，部分基质加标溶液呈现裂峰，将其稀释1 倍或进样量降为2 μL时，峰形明显改善.为保证峰形、简便操作将进样量调整为2 μL.
2）色谱柱选择及流动相比例优化：更换不同品牌色谱柱或更改不同流动相比例，均发现存在组分残留，采用文中的色谱柱及优化的流动相梯度（待目标峰全部出完后采用高比例有机相延长梯度洗脱时间），残留问题有改善.
2.5 柱残留问题的解决
试验中易柱残留的组分主要为沙星类，还有克霉唑和联苯苄唑，可在标准品溶液进样后同一方法连续进样基质空白2 次，观察以上组分残留均明显降低，必要时可取基质空白峰面积的平均值，计算含量时扣除空白干扰.
2.6 乙酸铵质量对峰形的影响
采用 A、B、C 三个不同品牌的质谱级乙酸铵配制流动相，发现不同品牌乙酸铵对米诺环素及克林霉素磷酸酯的峰形影响较大.图2 为不同品牌乙酸铵配制的流动相，相同色谱柱和进样量，进样同一浓度标准品溶液所得的色谱图.其中，采用B 品牌两组分峰形均较好，A 品牌米诺环素峰形最差.建议试验中若发现组分峰形较差，可考虑尝试更换不同品牌的乙酸铵.
图2 3 个品牌乙酸铵的标准品溶液色谱图
2.7 方法学验证
2.7.1 线性范围、检出限和定量限
精密吸取1.2.4 项下系列基质（膏霜基质）标准溶液依次进样测定，36 种组分在制备的浓度范围内均呈良好的线性关系（r≥0.99），检出限、定量限满足要求（见表3）.
表3 待测组分的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限
2.7.2 回收率试验
取膏霜类空白样品6 份，每份0.2 g，置15 mL 离心管中，分低、高2 个浓度组，每组3 份，加入混合标准溶液适量，按照样品前处理步骤处理制备质量浓度为200 ng/mL、1000 ng/mL 的克林霉素磷酸酯和氯霉素溶液，其余34 种组分配置对照品质量浓度为20 ng/mL、100 ng/mL 的加标溶液.进样分析，计算回收率（见表4）：平均加标回收率在84.1%～1 18.0%，相对偏差均不大于6.0%，表明该方法的准确性较好.
表4 36 种抗感染药物的加标回收率和RSD（n=3）
2.7.3 精密度
取基质标准溶液的高、低浓度重复进样6 次，根据峰面积计算上述36 种抗感染药定量离子对质谱峰面积的RSD.低浓度偏差RSD 不大于10%，高浓度偏差RSD 小于5%，表明该方法精密度良好.
2.8 样品测定
采用建立的优化方法，对不同品种不同基质共138 批次样品（市售115 批，网售23 批）进行36 种抗感染药物非法添加的快速筛查，1 批次网售宣称有中药止痒功效的乳膏检出添加酮康唑禁用组分，含量高达178 μg/g（最低定量浓度0.75 μg/g），超出近240 倍，严重危害消费者的健康.
抗感染类药物因其抗菌作用明显，易被不法分子添加在化妆品中，本文结合日常检验遇到的问题，对样品前处理、色谱条件等进行优化，对优化的方法进行方法学验证，在138 批次样品中检出1 批次阳性样品，确认建立的优化方法准确可靠、线性关系良好、适用性更强，可用于不同样品的36 种抗感染类药物快速筛查，提高了工作效率，可及时发现可疑样品，为化妆品监管提供有效技术支撑.同时对实验中遇到的标准品溶解、残留和乙酸铵质量影响峰形等问题展开深入分析和细致总结，可为化妆品检验人员熟练运用标准提供参考.
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