戴希爽，张 忠，毕 阳，William Oyom，张志鹏，谢鹏东
（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070）
番茄（Solanum lycopersicum）是茄科番茄属的一年生或多年生草本植物，在我国各地广泛栽培[1]。番茄果实营养丰富，风味独特，既可鲜食又可用于精深加工。番茄作为呼吸跃变型果实，常温下采后生理品质变化迅速，极易遭受采后病原真菌侵染[2]。其中由粉红单端孢菌（Trichothecium roseumPers. Link）侵染而引起的番茄红粉病，主要危害着色后的番茄果实，贮藏期间会造成大量腐烂[3]。目前防治番茄病害最普遍的方法是化学杀菌，但化学药剂频繁使用，不仅会导致病原菌产生耐药性，也不利于食品安全，亟需探索更安全有效可行的替代防治手段[4-5]。
多种植物源挥发性有机化合物不仅可有效抑菌，还能诱导增强果蔬抗病性[6]。大多数植物精油作为“一般公认安全”的物质，因其环境友好性和不易产生耐药性等优点而成为化学杀菌剂潜在的替代物[7]。孜然精油的主要活性成分枯茗醛（cuminal，CA）具有较广谱的抑菌活性和较强的抗氧化活性[8]，但由于疏水性限制了其在果蔬防腐保鲜中的应用。植物胶通常能在水中形成凝胶或稳定的乳液体系，具有较好的胶凝性、乳化性、热稳定性和成膜性，常作为天然涂层应用于果蔬防腐保鲜[9]。沙枣胶是沙枣树（Elaeagnus angustifoliaL.）茎枝中渗出的杂多糖聚合物，主要由阿拉伯糖、半乳糖、糖醛酸、鼠李糖及甘露糖等组成，相对分子质量约为2×105，其理化性质与阿拉伯胶、黄芩胶及桃胶等植物胶相似[10]。近年来关于果蔬涂膜的报道较多，如阿拉伯胶涂膜番茄[11]、番石榴[12]、草莓[13]和蓝莓[14]、桃胶涂膜番茄[15]以及黄芩胶涂膜杏果[16]等，均可有效增强果实抵御病原菌侵染的能力，抑制果实腐烂从而延长采后贮藏期[17]。然而关于沙枣胶与CA复合涂膜在果蔬采后病害控制及防腐中的应用研究尚鲜见报道。
本研究以沙枣胶与CA为原料制备复合膜液，通过浸渍法对番茄果实表面进行涂膜，探究复合涂膜对番茄采后红粉病的抑制作用及其对果实抗性的影响，以期为番茄采后病害控制及防腐提供方法参考和理论依据。
1.1 材料与试剂
供试材料：‘千禧’樱桃番茄采自甘肃永靖县刘家峡番茄种植园区，果实饱满处于成熟期，颜色、大小基本一致，无机械损伤和病虫害，于当天运回实验室；
沙枣胶采自新疆和田沙枣树造林区，自然干燥后备用。供试菌株T. roseum菌种取自甘肃农业大学食品科学与工程学院采后生物学实验室，从典型发病的番茄果实组织处分离，经培养纯化后于马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基中保存待用。
CA、L-苯丙氨酸、4-香豆酸 上海麦克林生化科技有限公司；
聚乙二醇-6000、愈创木酚、β-巯基乙醇、Triton X-100、邻苯二酚、福林酚 北京索莱宝科技有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；
UV-2450型紫外-可见光分光光度计 日本岛津医疗器械有限公司；
H-1850R台式高速冷冻离心机 长沙湘仪检测设备有限公司；
1510型酶标仪 赛默飞世尔仪器上海有限公司。
1.3 方法
1.3.1 孢子悬浮液的制备
菌种活化及孢悬液制备参照Ge Yonghong等[18]稍作修改。T. roseum菌株在PDA培养基上25 ℃培养7 d，加无菌水洗脱孢子，经4 层纱布过滤，调整孢悬液孢子浓度至1×106个/mL备用。
1.3.2 CA的体外抑菌活性测定
菌丝生长抑制参考Xu Dan等[19]的方法稍作修改。将15～20 mL PDA培养基分装到培养皿中，冷却凝固后在中心接种孢悬液，25 ℃培养24 h，分别将吸有0.625、1.25、2.5、5 μL CA的滤纸圆片（d＝8 mm）贴于皿盖中央，使其在培养皿内顶空浓度（通过顶空体积大小确定）分别为0.012 5、0.025、0.05、0.1 μL/mL，无菌水作对照，25 ℃倒置培养7 d，用十字交叉法测定第3、5、7天的菌落直径。按公式（1）计算菌丝生长抑制率。
孢子萌发抑制参考Wei Meilin等[20]的方法稍作修改。制取直径9 mm的PDA培养基圆饼置于灭菌载玻片上，接种孢悬液，将吸有0.625、1.25、2.5、5 μL CA的滤纸圆片（d＝8 mm）置于皿盖中央，无菌水作对照，25 ℃孵育后镜检统计孢子萌发情况，当对照组孢子萌发达到80%以上时开始计数。每次镜检200个真菌孢子。按公式（2）计算孢子萌发抑制率。
1.3.3 复合涂膜溶液的制备
将沙枣胶拣除可见杂质，参考阿吉艾克拜尔·艾萨等[21]的方法，粉碎过筛（100 目）得到沙枣胶粉末备用。根据前期预实验结果，制备3 组涂膜液：M1组：仅沙枣胶（OG）；
M2组：OG+0.1%（体积分数，下同）CA；
M3组：OG+0.2% CA。具体制备方法如下：取3 g的沙枣胶粉末溶解于100 mL蒸馏水并在45 ℃下磁力搅拌1 h，制得质量浓度30 mg/mL的沙枣胶膜基液。添加1.5 mL甘油作为增塑剂，然后在45 ℃下搅拌均匀并冷却至室温，即得到M1组。在M1组基础上加入0.1 mL CA（添加少量Tween-80作为乳化剂协助分散溶解），45 ℃下搅拌均匀后冷却至室温，即得到M2组。M3组涂膜液制备步骤同M2组，但CA添加量为0.2 mL，其余参数不变。
1.3.4 涂膜和接种
取新鲜番茄果实用蒸馏水洗净，放入体积分数为1%的次氯酸钠溶液中浸泡2 min，捞出后自然晾干。每组50个果实，分别用M1、M2、M3组涂膜液处理，对照组为无菌水处理。各组果实均浸渍约30 s后，膜液完全覆盖果实表面，完成涂膜。待果实自然风干后在其中轴线赤道部位对称打2个孔（直径2 mm、深3 mm），接种5 μL的T. roseum孢悬液，静置使孢子稳定附着。用塑料保鲜盒密封于相对湿度90%～95%的室温（25±1）℃环境下贮藏。
1.3.5 病斑直径和发病率的测定
依次在贮藏第1、3、5、7、9天利用十字交叉法测量病斑直径并记录发病果实孔数。病斑直径≥2 mm且孔内可见菌体记为发病孔数[22]，并按照公式（3）计算果实接种发病率。
1.3.6 抗氧化指标测定
依次在贮藏第0、1、3、5、7、9天取病健交界组织处（病斑周围1.5 mm处）的果肉进行各项抗性指标的测定[23]。
1.3.6.1 抗性物质含量测定
过氧化氢（H2O2）含量采用试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定，H2O2含量单位μmol/gmw。总酚含量和类黄酮含量测定参考Li Zhicheng等[24]的方法，分别测定反应体系在波长760 nm和510 nm处的吸光度。用没食子酸标准曲线计算总酚含量（单位为mg/100 gmw），用儿茶素标准曲线计算类黄酮含量（单位为mg/100 gmw）。
1.3.6.2 抗性酶活力测定
过氧化物酶（peroxldase，POD）活力测定参考曹建康等[25]的方法。以每克果实组织（鲜质量）吸光度每分钟增加1为1个POD活力单位，POD活力以ΔOD470nm/（min·gmw）表示。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）活力和4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate:coenzyme A ligase，4CL）活力测定方法分别参照Han Cong[26]和Takshak[27]等的方法并稍作调整，分别测定其反应体系在波长290 nm和340 nm处的吸光度，以每克果实组织（鲜质量）吸光度每小时变化0.01为1个酶活力单位U，结果以U/gmw表示。
1.4 数据处理与分析
上述实验均重复3 次，数据采用Microsoft Excel 2016软件计算，表示为平均值±标准差，并用SPSS 20.0软件进行Duncan’s多重差异显著性分析（P＜0.05表示差异显著），采用Origin 2018 Lab软件绘图。
2.1 CA的体外抑菌活性
CA可明显抑制离体T. roseum的菌落生长。在0.012 5～0.1 μL/mL顶空浓度范围内，浓度越高，抑制效果越明显。与对照组相比，0.1 μL/mL CA处理的T. roseum菌落生长最为缓慢（图1A）。在培养第7天，0.0125、0.025、0.05、0.1 μL/mL CA处理的T. roseum菌丝生长抑制率分别为15.3%、35.7%、47.5%、72.9%（图1B）。CA可有效抑制T. roseum孢子萌发，其抑制效果呈浓度剂量效应（图1C）。培养至第9小时，不同浓度CA处理的T. roseum孢子萌发抑制率分别达到38.5%、64.5%、76.3%、83.0%。表明CA对T. roseum生长具有较强的体外抑制活性。
图1 不同浓度枯茗醛处理对粉红单端孢菌落形态（A）、菌丝生长抑制率（B）和孢子萌发抑制率（C）的影响Fig. 1 Effects of different concentrations of cuminal on the colony morphology (A), mycelial growth (B) and spore germination (C) of T. roseum in vitro
2.2 复合涂膜对接种番茄红粉病的抑制作用
涂膜组番茄果实的病斑面积均不同程度小于对照组（图2A）。果实经损伤接种T. roseum后，病斑直径随贮藏时间延长而扩大（图2B）。OG+0.1% CA、OG+0.2% CA复合涂膜组果实的病斑直径均显著低于对照组（P＜0.05），9 d后分别为对照组的51.9%、36.7%。贮藏期间果实发病率也逐渐上升（图2C）。OG+0.1% CA、OG+0.2% CA复合涂膜组果实的发病率均显著低于对照组（P＜0.05），9 d后分别为对照组的76.7%、69.2%。结果表明，沙枣胶与CA复合涂膜明显抑制了番茄红粉病的发生与发展。
图2 复合涂膜对番茄损伤接种粉红单端孢后病情发展（A）、病斑直径（B）及发病率（C）的影响Fig. 2 Effect of composite coating on disease development (A), lesion diameter (B) and disease incidence (C) in tomato fruit inoculated with T. roseum
2.3 复合涂膜对果实抗性的影响
2.3.1 H2O2含量
H2O2是活性氧的典型代表，参与果蔬抗病性、抗逆性启动和诱导过程。从整体上看，H2O2含量呈先升后降再升的变化趋势（图3）。贮藏前期0～5 d内，OG+0.2% CA复合涂膜组果实的H2O2含量显著高于对照组（P＜0.05），且在第3天达到峰值。贮藏5 d后，番茄果实后熟逐渐开始腐烂，体内H2O2过量积累，涂膜组果实的H2O2含量显著低于对照组（P＜0.05）。表明沙枣胶与CA复合涂膜促进了果实贮藏前期H2O2含量快速产生，贮藏后期又抑制了H2O2过量积累，减缓过氧化对果实产生的伤害。
图3 复合涂膜对番茄损伤接种后果实中H2O2含量的影响Fig. 3 Effect of composite coating on the content of H2O2 in inoculated tomato fruit
2.3.2 总酚和类黄酮含量
果蔬中总酚和类黄酮等次级代谢产物与体内抗性密切相关。对照组和涂膜组果实中总酚含量变化趋势基本一致，可能是因酚类物质贮藏期间容易氧化还原，在贮藏前期稍有下降后便逐渐上升，且在第7、9天达到峰值（图4A）。复合涂膜组果实的总酚含量在贮藏第7天之前显著高于对照组（P＜0.05）。OG+0.2% CA复合涂膜组果实的总酚含量（高出对照14.7%）在第7天到达峰值，比OG+0.1% CA复合涂膜组果实总酚含量峰值（高出对照组5.5%）提早了2 d，但在贮藏末期稍有下降。各组果实中类黄酮含量随贮藏时间延长先上升后下降（图4B）。OG+0.2% CA复合涂膜组果实的类黄酮含量在贮藏前期0～3 d内上升较快且显著高于对照组（P＜0.05），在第3天到达峰值，高出对照组48.1%，而其余组在第5天才达到峰值并趋于平稳。表明沙枣胶与CA复合涂膜促进了番茄果实中总酚和类黄酮的积累。
图4 复合涂膜对番茄损伤接种后果实中总酚（A）和类黄酮（B）含量的影响Fig. 4 Effect of composite coating on the contents of total phenols (A)and flavonoids (B) in inoculated tomato fruit
2.3.3 POD活力
POD作为重要的抗氧化酶之一，与植物体内活性氧清除及抗病性密切相关。贮藏期间，果实中POD活力整体呈先升后降的趋势（图5）。复合涂膜组果实的POD活力在贮藏前期逐渐上升且始终高于对照组（P＜0.05）。OG+0.1% CA复合涂膜组果实的POD活力（高出对照组34.9%）在第5天到达峰值，比OG+0.2% CA复合涂膜组果实POD活力峰值（高出对照45.5%）提前了2 d。而对照组和OG组果实的POD活力变化平稳，在第3、7天均有峰值出现。表明沙枣胶与CA复合涂膜提高了番茄果实贮藏期间POD活力。
图5 复合涂膜对番茄损伤接种后果实中POD活力的影响Fig. 5 Effect of composite coating on the activity of POD in inoculated tomato fruit
2.3.4 PAL和4CL活力
PAL和4CL是苯丙烷代谢途径中重要的关键酶和限速酶，与果蔬抗病性密切相关。贮藏期间，对照组和涂膜组果实中PAL活力变化趋势基本一致，总体先升后降（图6A）。复合涂膜组果实PAL活力在贮藏第5天显著高于OG涂膜组和对照组（P＜0.05）。对照组、OG组、OG+0.1% CA组PAL活力在第3天达到高峰，之后不断下降，而OG+0.2% CA组在第5天才达到峰值，上升幅度最高，高出对照组31.6%，高出OG组25.3%。各组果实中4CL活力整体表现为先升后降（图6B）。对照组与OG组4CL活力变化差异不明显，而OG+0.2% CA复合涂膜组4CL活力始终显著高于对照组（P＜0.05），在第7天达到峰值，高出对照组13.3%，高出OG组12.3%。表明沙枣胶与CA复合涂膜提高了番茄果实贮藏期间PAL活力和4CL活力。
图6 复合涂膜对番茄损伤接种后果实中PAL（A）和4CL（B）活力的影响Fig. 6 Effect of composite coating on the activity of PAL (A) and 4CL (B)in inoculated tomato fruit
CA可显著抑制T. roseum的菌丝生长以及孢子萌发，此外，能有效抑制花生等农产品中黄曲霉的生长和产毒[19]，降低链格孢对采后果蔬的侵染活力[28]。孜然精油的主要活性成分CA对病原菌的抑菌机制通常与抑制孢子萌发、破坏病原菌细胞膜、诱导胞内活性氧爆发以及线粒体功能紊乱等引起细胞凋亡有关[8]。精油的抑菌活性一般是通过其主要活性成分的作用来实现的，如肉桂精油中的活性成分肉桂醛可抑制由灰葡萄孢侵染引起的番茄灰霉病[29]和由扩展青霉侵染引起的番茄果腐病[30]，香草精油中的活性成分香兰素可抑制由链格孢侵染引起的番茄黑腐病[31]。精油对多种果蔬采后病害有显著的抑制效果，甚至在一定浓度时能完全抑制果蔬采后病原菌的生长[32]。同时，沙枣胶与CA复合涂膜显著降低果实发病率并延缓病斑直径的扩展，类似的结果在以漂白紫胶、百里酚和水杨酸复合涂膜后的番茄果实上也有报道[33]。
提高果蔬采后抗病性也是抑制果蔬采后病害的重要作用机制之一[32]。果蔬在受到病原菌侵染或不良环境胁迫时，体内活性氧爆发产生的H2O2既可直接抗菌，也能调控相关应答胁迫的系列信号传导，如作为激活苯丙烷代谢的第二信使[34]，启动寄主多种防御反应。H2O2还可诱导促进果实细胞壁结构蛋白的氧化交联，POD则通过催化酚类前体聚合为木质素来加固细胞壁，从而增强对病原菌侵染的抵御能力[35]。贮藏后期果实后熟随之病情扩散，活性氧过度累加会对果实细胞本身造成破坏，而POD又能及时清除体内过量的H2O2，抑制膜脂过氧化，延缓果实成熟与衰老[36]。本实验中，贮藏前中期（0～5 d），沙枣胶与CA复合涂膜促进了番茄果实中H2O2的快速积累，提高了POD等抗病相关酶活力；
贮藏后期（5 d后）复合涂膜又抑制了体内H2O2过量积累，减缓过氧化对果实产生的伤害。其中沙枣胶与0.2% CA复合涂膜效果最为显著。H2O2作为信号分子，激活POD和PPO等抗性酶活力明显升高，类似结果在肉桂精油复合壳聚糖涂膜番木瓜[37]和生姜精油复合壳聚糖涂膜鲜银耳[38]的研究中也有报道。因此，H2O2与POD在植物精油诱导抗性中发挥着重要作用，其前期持续的高含量提高了番茄果实抵抗病原菌入侵的应激防御能力。
苯丙烷代谢是果蔬中次生代谢的主要环节[39]，能够调控酚类、黄酮类、木质素等主要抗菌物质的积累，在抗病防御反应中具有重要地位[40]。PAL和4CL是苯丙烷代谢的关键酶。PAL催化苯丙氨酸转化为肉桂酸，4CL调控苯丙烷代谢主途径向分支途径转折，其下游代谢产物如水杨酸、木质素等参与果实抗性反应[41]。总酚和类黄酮是苯丙烷代谢的最终产物，其产生速度与积累量通常反映了果实抗病性的强弱[42]。本研究中，与对照组及沙枣胶单独涂膜组相比，沙枣胶与CA复合涂膜显著提高了番茄果实体内的PAL活力和4CL活力，并促进了总酚和类黄酮等代谢产物的积累。类似的结果在丁香精油处理后的冬枣果实[43]、茶树精油处理后的草莓果实[44]及香芹酚处理后的黑莓果实[45]研究中也有报道，表明植物精油可通过促进果蔬苯丙烷代谢进程，增强果蔬对病害的抗性。
综上所述，CA在体外条件下对番茄红粉病病原菌T. roseum具有显著的抑制活性。沙枣胶与CA复合涂膜可通过促进果实H2O2快速积累，激活苯丙烷代谢途径，提高POD、PAL和4CL等抗性酶活力，以及总酚和类黄酮等代谢抗性产物的积累，诱导增强番茄果实抗病性。所以，沙枣胶与CA复合涂膜控制番茄采后红粉病发生并抑制果实腐烂的作用机制部分归因于CA对病原真菌T. roseum的直接抑制效果，但更重要的是与CA作为活性成分诱导番茄果实增强抗性有关。然而在分子水平上，活性成分CA是否影响并且如何影响苯丙烷代谢途径基因的表达需要进一步研究，也可能是多种代谢通路相互作用的结果。此外，不同品种和成熟度的果蔬、病原菌以及接种时间对采后果蔬抗病性的影响可能不同，下一步可考虑扩大研究范围，以便更全面地揭示精油活性成分对采后果蔬抗病性的影响。
CA处理对番茄红粉病病原菌T. roseum具有显著的体外抑制活性。沙枣胶与0.2% CA复合涂膜可较好地控制番茄采后红粉病的发生，抑制果实病斑扩展。该复合涂膜促进了贮藏前期番茄果实中H2O2、总酚和类黄酮等抗性物质的积累，并提高了POD、PAL和4CL等抗性酶活力，增强了番茄果实抗病性。以上结果表明，沙枣胶与CA复合涂膜是一种潜在有效的采后番茄防腐手段。
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