吴玉泓， 郝民琦， 李海龙*， 殷银霞， 梁永林， 张 磊， 李晓玲， 王瑞琼，程小丽
[1.深圳大学附属华南医院，广东 深圳 518111；
2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000；
3.北京中医药大学深圳医院(龙岗)，广东 深圳 518172]
溃疡性结肠炎又称非特异性溃疡性结肠炎，发病率在全球范围内呈上升趋势，发病机制涉及多种影响因素如遗传、免疫、环境等[1]，其病因仍不明确，临床症状主要表现为腹泻、腹痛以及黏液脓血便，病情轻重不等，多呈反复发作的慢性病程[2]。
自噬意为“自食”，是捕获和降解溶酶体中受损蛋白和细胞器的分解代谢过程[3]，其可对肠道免疫调节起到重要作用[4]，而巨噬细胞调节紊乱可导致炎性肠病的发生[5]，近年来自噬在炎性肠病的发病及相关药物治疗机制中被证实，因而受到持续关注[6]。自噬体的形成依赖于一系列自噬相关蛋白(ATG)在蛋白泛素化过程中共价结合，其核心基因ATG5和ATG12亦参与了细胞凋亡的调控[7]。
本课题组在临床实践中发现，针对慢性复发性顽固溃疡性结肠炎，理中汤和四神丸所体现的温补脾肾疗法往往能够取得较好的疗效，且前期研究发现，在构建的脾肾阳虚大鼠模型中，自噬相关信号通路JNK/Beclin1/Bcl-2被激活，而应用理中汤合四神丸干预后，可抑制通路关键因子及自噬相关蛋白LC3B表达[8-9]，故本研究继续探讨理中汤合四神丸对于溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜自噬相关基因表达的影响及结肠黏膜超微结构与凋亡形态学的改变，进一步发掘自噬在理中汤合四神丸治疗溃疡性结肠炎中发挥的作用。
1.1 动物 60只SPF级Wistar雄性大鼠，体质量(180±20)g，由甘肃中医药大学科研实验中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(甘)2015-0002，实验动物使用许可证号SYXK(甘)2015-0005，饲养环境为12 h/12 h明暗交替光照，相对湿度50%～60%，温度21～25 ℃，噪音<50 dB。
1.2 药物 理中汤合四神丸原料药材及大黄均购自甘肃中医药大学附属医院，经同院药剂科主任医师杨锡仓鉴定合格，根据《中国药典》依法炮制，人参、炒白术、干姜、炙甘草、吴茱萸、补骨脂、肉豆蔻、五味子比例为3∶3∶3∶3 :1∶4∶2∶2，按常法煎煮，冷却后置4 ℃冰箱中备用，使用时稀释至所需质量浓度。美沙拉嗪(批号20200406)，购自黑龙江天宏药业股份有限公司。
1.3 试剂 2，4-二硝基苯磺酸(DNBS，批号STBH2928)，购自美国Sigma公司；
氢化可的松注射液(批号1902210)，购自国药集团容生制药有限公司；
ATG5、GAPDH抗体(货号YM3752、YM3215)，购自美国 Immunoway公司；
ATG12、DRAM1、P62抗体(货号bs-4012R、bs-10285R、bs-2951R)，购自北京博奥森生物技术有限公司；
荧光定量、反转录、显影及凋亡检测试剂盒(货号H1001350、H3001010、S8021530、T0901011)，购自上海翌圣生物科技有限公司。
1.4 仪器 LightCycler@96型实时荧光定量聚合酶链式反应仪，购自德国罗氏生物系统公司；
电泳仪、蛋白转印模块、曝光机，购自美国Bio-Rad公司；
切片机，购自德国Leica公司；
IX51型显微镜，购自日本Olympus公司；
HT7700型透射电子显微镜，购自日本日立公司。
2.1 分组及造模 大鼠随机分为空白组、模型组、美沙拉嗪组(0.36 g/kg)及理中汤合四神丸低、中、高剂量组(3.5、7、14 g/kg)，除空白组外，其余各组参考文献[10]报道及DNBS诱导结肠炎模型[11-12]制备脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠模型，并应用DNBS代替三硝基苯磺酸(TNBS)进行优化，即灌胃大黄水煎液(13.5 g/kg)14 d+肌肉注射氢化可的松(25 mg/kg)7 d以复制脾肾阳虚大鼠模型，空白组灌胃等体积生理盐水及注射等体积蒸馏水。脾肾阳虚证候模型复制成功后，禁食不禁水24 h，以DNBS/乙醇溶液(每只大鼠35 mg DNBS+0.25 mL 50%乙醇)缓慢注入大鼠结肠肠腔，空白组注入0.25 mL生理盐水。
2.2 给药及标本采集 大鼠造模成功后第21天，理中汤合四神丸低、中、高剂量组灌胃给予3.5、7、14 g/kg药液，美沙拉嗪组灌胃给予0.36 g/kg美沙拉嗪，空白组及模型组灌胃给予等体积蒸馏水，连续14 d。末次给药后，大鼠禁食不禁水24 h，麻醉采血后脱颈处死，低温下迅速剖取肛门上约8 cm的结肠组织，生理盐水冲洗，滤纸吸干水分后纵向切开，一部分于4%多聚甲醛溶液中固定，另一部分于-80 ℃保存待测。
2.3 大鼠一般状态观察 每天观察并记录大鼠精神状态、饮食量增减、活动度、粪便情况。取材后观察固定于多聚甲醛中的大鼠结肠黏膜标本，将标本用大头针固定于洁净板上，0.9%氯化钠浴液保湿，放大镜观察结肠黏膜受损程度，观察肠黏膜组织糜烂、充血、水肿、溃疡、出血等情况。
2.4 RT-qPCR法检测大鼠结肠黏膜组织ATG5、ATG12、DRAM1、P62 mRNA表达 TRIzol法提取结肠组织总RNA，逆转录为cDNA扩增模板，按扩增试剂盒说明书推荐设置循环条件，2-ΔΔCT法定量分析基因表达量。引物序列见表1。
表1 引物序列
2.5 免疫组化法检测结肠黏膜组织中ATG5、ATG12、DRAM1、P62表达情况 将多聚甲醛固定的结肠组织包埋于蜡块中，切成4 μm薄片，65 ℃烘烤，脱蜡后使用柠檬酸钠热修复，过氧化氢封闭，血清封闭，一抗4 ℃过夜，次日二抗孵育，DAB显色，中性树胶封片，拍照后分析处理。
2.6 Western blot法检测大鼠结肠黏膜组织中 ATG5、ATG12、DRAM1、P62蛋白表达 取100 mg结肠组织剪碎，使用RIPA 裂解液充分裂解并测定蛋白浓度后，将蛋白样品加热变性用于电泳上样。电泳后将蛋白转印到PVDF膜，条带经胎牛血清封闭后孵育对应抗体(ATG5，1∶1 000；
ATG12，1∶500；
DRAM1，1∶1 000；
P62，1∶1 000)4 ℃过夜，洗膜后孵育HRP二抗(1∶8 000)2 h，ECL显色，并采用 Image J软件分析结果。
2.7 电镜观察大鼠结肠细胞自噬情况 新鲜组织确定取材部位，迅速投入电镜固定液4 ℃固定2～4 h。0.1 mol/L磷酸缓冲液PB(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min，1%锇酸-0.1 mol/L PB室温固定2 h，PB漂洗3次，每次15 min，脱水后进行渗透，即丙酮和812包埋剂(1∶1)渗透2～4 h，丙酮和812包埋剂(2∶1)渗透过夜，纯812包埋剂渗透5～8 h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37 ℃烤箱过夜。包埋后切片，染色后于透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
2.8 TUNEL法检测大鼠结肠组织中凋亡细胞情况 二甲苯浸泡石蜡组织切片，脱蜡，梯度脱水后PBS洗片，PBS稀释Proteinase K溶液，润洗样本，置于湿盒中避免干燥。固定好样本后进行染色，将载玻片浸没在装有PI溶液的染缸内染色5 min，洗涤后于荧光显微镜下观察分析样本，(520±20)nm波长下观察绿色荧光，460 nm波长下观察蓝色的DAPI染核。
3.1 大鼠一般状态 空白组大鼠饮食及大便性状正常，精神、活动佳，毛发光亮整洁，体质量持续增长；
模型组大鼠饮食饮水量减少，大便稀，甚至带血，精神萎靡，活动量减少，弓背眯眼，扎堆，形体消瘦，毛色枯槁；
各给药组大鼠一般情况均有明显好转，以美沙拉嗪组及理中汤合四神丸高剂量组最为明显，且对于诸如精神萎靡、反应迟钝、喜扎堆等脾肾阳虚症状，理中汤合四神丸组效果优于美沙拉嗪组。
3.2 理中汤合四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中ATG5、ATG12、DRAM1、P62 mRNA表达的影响 如表2所示，与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中ATG5、ATG12、DRAM1 mRNA表达均升高(P<0.01)，P62 mRNA表达降低(P<0.01)；
与模型组比较，除理中汤合四神丸低剂量组DRAM1 mRNA无明显变化(P>0.05)，各给药组大鼠结肠组织中ATG5、ATG12、DRAM1 mRNA表达均降低(P<0.01)，P62 mRNA表达升高(P<0.05，P<0.01)，其中以理中汤合四神丸中、高剂量组及美沙拉嗪组效果最为明显。
表2 各组大鼠ATG5、ATG12、DRAM1、P62 mRNA表达比较
3.3 理中汤合四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中ATG5、ATG12、DRAM1、P62蛋白免疫组化表达的影响 如图1、表3所示，与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中ATG5、ATG12、DRAM1蛋白表达升高(P<0.01)，P62蛋白表达降低(P<0.01)；
与模型组比较，各给药组ATG5、ATG12、DRAM1蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，除理中汤合四神丸中、低剂量组P62蛋白表达无明显变化(P>0.05)外，其余给药组P62蛋白表达均升高(P<0.01)。
表3 各组大鼠ATG5、ATG12、DRAM1、P62蛋白免疫组化表达比较
3.4 理中汤合四神丸对大鼠结肠组织中 ATG5、ATG12、DRAM1、P62蛋白表达的影响 如图2、表4所示，与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中ATG5、ATG12、DRAM1蛋白表达升高(P<0.01)，P62蛋白表达降低(P<0.01)；
与模型组比较，各给药组ATG5、ATG12、DRAM1蛋白表达降低(P<0.01)，除理中汤合四神丸中、低剂量组P62蛋白表达无明显变化(P>0.05)外，其余给药组P62蛋白表达均升高(P<0.05)。
表4 各组大鼠结肠中ATG5、ATG12、DRAM1、P62 自噬相关因子蛋白含量比较
3.5 理中汤合四神丸对大鼠结肠组织电镜下结构的影响 如图3所示，空白组大鼠结肠(图3A1～3A2)肠屏障相对较完整，微绒毛(Mv)排列较整齐，结构致密、粗细均一，粗面内质网(RER)结构正常，未见明显扩张，该视野未见典型自噬小体及自噬溶酶体；
模型组大鼠结肠(图3B1～3B2)肠屏障损伤相对严重，部分上皮细胞崩解，细胞膜大面积破损，细胞基质游离，Mv大面积退化、脱落、消失，RER明显扩张，脱颗粒、空泡变，自噬溶酶体(ASS)数量较多；
理中汤合四神丸低剂量组大鼠结肠(图3C1～3C2)肠屏障中度退变，Mv排列紊乱，稀疏，局部微绒毛脱落，RER轻度扩张，ASS个别存在；
中剂量组大鼠结肠(图3D1～3D2)肠屏障轻度水肿，Mv分布不均匀，RER轻度扩张，未见明显自噬小体及自噬溶酶体典型结构；
高剂量组大鼠结肠(图3E1～3E2)肠屏障结构轻微损伤，细胞膜完整，Mv排列均匀、致密，粗细均一，个别囊膜扩张，ASS少量存在；
美沙拉嗪组大鼠结肠(图3F1～3F2)肠屏障结构轻度损伤，细胞膜完整，Mv排列稀疏，局部退化，RER未见明显扩张，ASS个别存在。
3.6 理中汤合四神丸对大鼠结肠组织凋亡的影响 如图4、表5所示，空白组中绿色荧光标记的凋亡细胞数量最少，凋亡细胞与总细胞重合最少，凋亡阳性细胞表达率最低；
与空白组比较，模型组结肠组织细胞凋亡情况最为严重，凋亡细胞与总细胞重合最多，凋亡阳性细胞表达率升高(P<0.01)；
与模型组比较，美沙拉嗪组与理中汤合四神丸各剂量组细胞凋亡率均有下降，凋亡细胞与总细胞重合均减少，以美沙拉嗪组和理中汤合四神丸中、高剂量组最为明显(P<0.01)，其中理中汤合四神丸低剂量组细胞凋亡率与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
表5 各组大鼠结肠组织中凋亡细胞相对面积比较
中医认为溃疡性结肠炎的发病病机在于脾虚，脾虚则久泻久利，亦因久泻可伤肾，久病亦可及肾，故脾肾阳虚为复发性难治型溃疡性结肠炎的最终转归。细胞自噬是除了细胞凋亡外的另一重要死亡调控机制，其在特定条件下，适度的激活对于细胞起到保护性的作用，而当自噬启动不足或者过度的自噬激活则会引起细胞的损伤，甚至诱发细胞出现自噬性死亡，而自噬性细胞死亡又被称为Ⅱ型程序性细胞死亡，因此自噬具有双面性[13-14]。
自噬相关蛋白(ATG)在参与调节自噬的起始以及延伸阶段，为一类自噬组成蛋白。研究发现，ATG5和ATG12等基因的编码区核苷酸重复而导致的框移突变，可使其蛋白的表达不完整进而引起自噬的失活[15]，其耦联与LC3转化2个泛素化过程是自噬的关键[16]，可由ATG7(类泛素激活酶)和ATG10(类泛素结合酶)共同催化形成[17]，随后与膜结合，促进自噬体形成[18]。此外,ATG12-ATG5复合物还可以充当ATG8-磷脂酰乙醇胺结合系统的E3样连接酶，其缺失会导致自噬缺陷[19]。损伤调节自噬蛋白(DRAM1)为一种疏水蛋白[20]，在应激情况下，DRAM1可被激活，其沉默可阻断自噬的发生，下调能够减轻细胞自噬和死亡，对于DNA损伤情况下诱导的自噬和凋亡非常关键[21]。P62参与自噬溶酶体的降解过程，并且本身又可以受到自噬的调节[22-23]，其作为自噬的选择性底物之一，表达的变化可以被看作自噬能力的指征[24]。
研究结果表明，在脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中，自噬相关蛋白ATG5、ATG12、DRAM1表达均升高，P62表达降低，各给药组结肠组织中ATG5、ATG12、DRAM1表达降低，P62表达升高，其中以理中汤合四神丸中、高剂量组和美沙拉嗪组最为明显。电镜结果显示，模型组大鼠结肠黏膜细胞结构破坏严重，自噬溶酶体数量较多，而各给药组大鼠结肠黏膜细胞组织结构均有所改善，自噬溶酶体数量亦有所减少，并且TUNEL结果显示，理中汤合四神丸可以减轻溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜凋亡情况，提示理中汤合四神丸可能通过抑制脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织自噬相关蛋白ATG5、ATG12、DRAM1表达，同时上调P62表达，进而对结肠细胞自噬起到抑制作用，以避免其过度自噬，并缓解了结肠黏膜细胞的凋亡情况，进而对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎起到保护作用。
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