吴志强，肖玉娇，谷丽瑶，李 旭，张佩雯，王梨力，肖金银，罗 敏
(湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005)
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis， UC)主要特点为肠道黏膜非特异性炎症[1-3]，UC目前发病机制不明，主要与免疫功能异常、肠道环境失调、遗传、感染、心理、饮食等因素有关[4]。研究发现[5]，内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)与肠黏膜屏障受损有关，肠黏膜屏障受损是UC发生的重要原因。研究表明，UC发病与PERK通路关系密切，PERK通路被激活后，促炎因子的分泌增加，炎性细胞聚集，发生炎症反应[6-7]。
另外，PERK 通路是诱导细胞凋亡的重要途径[8]，通路激活后C/EBP 同源蛋白(C/EBP homolo-gous protein，CHOP)增加，促进细胞凋亡[9-10]。肠道上皮组织主要由杯状细胞(Goblet cells，GC)构成[11-12]。相关实验研究显示，当发生ERS 时，PERK通路被激活，CHOP的表达增加，加速细胞凋亡，导致相应的杯状细胞形态改变，数量减少，肠屏障受损，导致肠道自发性炎症[13]。前期实验发现芍药汤能抑制UC大鼠结肠PERK信号通路的激活，起到治疗UC的作用。本研究在前期研究的基础上，进一步探讨芍药汤对UC中内质网应激PERK信号通路介导细胞凋亡及杯状细胞破坏的调控作用。
1.1 实验动物 来自湖南斯莱克景达实验动物有限公司84只SPF级SD大鼠，体重180～220 g，雄性，质量合格证号：43072721102432363，饲养于湖南中医药大学动物实验室。本实验经湖南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会批准(LLBH-20210910001)。
1.2 实验药物 芍药汤组方：芍药30 g，当归、黄连、黄芩各15 g，槟榔、木香、炙甘草各6 g，大黄9 g，肉桂5 g。中药配方颗粒由湖南中医药大学第二附属医院中药颗粒药房提供。芍药汤中剂量按成人用量的10倍计算，即9.2 g/kg(生药量,下同)，药物用蒸馏水配成920 g/L，疗程14 d。柳氮磺吡啶片，0.25 g/片，批号22180510。片剂研粉后过100目筛，使用时按照0.3 g/kg蒸馏水冲兑灌胃，疗程14 d。
1.3 主要试剂 PAS染色套装(G1008)、二甲苯(100092683)、2,4,6-三硝基苯磺酸、水合氯醛、4%多聚甲醛(BS)、RNA提取液(G3013)、无水乙醇(10009218)、BSA(G5001)、苏木素染色(G1004)。
1.4 主要仪器 脱色摇床(谷歌生物，TSY-B)；
脱水机(意大利DIAPATH，Donatello)；
包埋机(武汉俊杰，JB-P5)；
冻台(武汉俊杰，JB-L5)；
组织摊片机(浙江科迪，KD-P)；
显微镜(日本尼康，NIKON ECLIPSE E100)；
研磨仪(低温型 Servicebio，KZ-Ⅲ-FP)；
荧光定量PCR仪(Bio-rad，CFX)；
超净工作台(苏净安泰，SW-CJ-1FD)；
掌上离心机(谷歌生物，D1008E)；
病理切片机(上海徕卡，RM2016)。
1.5 实验动物分组和UC大鼠模型的制备[14]将SD大鼠适应性喂养7 d后进行编号，随机选取14只大鼠作为空白组。提前禁食24 h，将SD大鼠用10%水合氯醛按照0.3 ml/kg进行腹腔注射麻醉，麻醉完成后，空白组大鼠从肛门用灌胃针头推入0.9%氯化钠溶液4 ml/kg；
其余SD大鼠用三硝基苯磺酸制作UC大鼠模型[15]，造模后正常饲养。造模4 d后，随机抽取1只大鼠处死并解剖，距肛缘6～10 cm结肠处肉眼可见溃疡面，病理检查发现炎性改变及典型溃疡面时，即造模成功。造模期间，死亡7只大鼠(包括处死1只)，解剖发现可能为炎症刺激导致结肠粘连梗阻穿孔死亡。造模完成后，将余下大鼠随机分为模型组12只、柳氮磺吡啶组13只、芍药汤低剂量组12只、芍药汤中剂量组13只、芍药汤高剂量组13只。
1.6 给药方法 芍药汤高剂量组：按照含生药量18.4 g/(kg·d)灌胃；
芍药汤中剂量组：按照含生药量 9.2 g/(kg·d)灌胃；
芍药汤低剂量组：按照含生药量4.6 g/(kg·d)灌胃；
柳氮磺吡啶组：按照 0.3 g/(kg·d)灌胃；
模型组和空白组：予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。均1次/d，连续14 d。
1.7 取 材 末次给药后，禁食24 h，脱颈椎法处死所有大鼠后解剖，取距肛门8 cm处结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，观察大鼠结肠组织并进行评分，取病变最明显处组织样品均分为两份，一份浸入40 g/L的多聚甲醛固定液中，常规石蜡包埋、切片，用于免疫组化及PAS 染色；
一份投入液氮中冷冻待 RT-PCR 检测。
1.8 观察指标
1.8.1 大鼠疾病活动指数(DAI)：在末次灌药后，进行DAI评分。DAI评分=(体重下降分数+大便性状分数+便血分数)/3。标准如下，0 分：大便正常，无体重减轻；
1 分：大便正常，大便隐血(-)，体重下降 1%～5%；
2 分：大便较软，大便隐血(+)，体重下降 5%～10%；
3 分：大便较软，大便隐血(+)，体重下降 10%～15%；
4 分：稀便，肉眼血便，体重下降>15%[15]。
1.8.2 大鼠的结肠黏膜损伤指数(CMDI)：CMDI 评分标准为，0分：无溃疡及充血；
1分：无溃疡，轻度黏膜充血；
2分：无溃疡，黏膜充血；
3分：小溃疡，直径约0～1 cm；
4分：溃疡直径约 1～2 cm，与周围组织无粘连；
5分：溃疡直径约 1～2 cm，与周围组织粘连[16]。
1.8.3 大鼠结肠组织p-PERK的蛋白表达：免疫组化法检测大鼠结肠组织p-PERK的蛋白表达水平。石蜡切片，脱蜡，进行抗原修复，然后放入3%过氧化氢溶液中孵育，继续在脱色摇床上晃动洗涤，进行血清封闭，加一抗、二抗，置于PBS(pH7.4)在脱色摇床上晃动洗涤。滴加DAB显色液，Harris苏木素复染，脱水封片，显微镜镜检，图像采集。
1.8.4 大鼠结肠黏膜组织中CHOP水平：采用RT-PCR法检测结肠黏膜组织中CHOP水平。总RNA抽提方法为，取匀浆管，加入RNA提取液，取100 mg组织，加入到匀浆管中。研磨，离心，加入250 μl三氯甲烷离心，然后加入异丙醇离心，提取RNA。吸除液体，加入75%乙醇洗涤沉淀离心。将离心管置于超净台上吹干，加入15 μl无RNA酶的水溶解孵育，检测RNA浓度及纯度。按照逆转录程序设定进行逆转录。采用 2-k 值表示该基因的相对表达水平，A=CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)，B=CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)，k=A-B，表达倍数=2-k。
1.8.5 大鼠结肠黏膜组织中杯状细胞数量：采用PAS染色法检测大鼠结肠组织GC数量。依次将切片放入二甲苯及无水乙醇中，自来水洗，切片入PAS染色液B中染色，自来水洗，蒸馏水洗。然后PAS染色液A中染色，流水冲洗，PAS染色液C染，盐酸水溶液分化，用自来水洗及氨水返蓝。最后中性树胶封片，显微镜观察。
1.9 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件，图片用Image J及Graphpad Prism 8.0分析。对符合正态性检验和方差齐性检验的，以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，不符合正态性检验和方差齐性检验的，以M(P25,P75)表示，采用非参数检验(Kruskal-Wallis)；
P<0.05 为差异具有统计学意义。
2.1 各组大鼠DAI、CMDI评分比较 见表1。与模型组比较，柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中、低剂量组DAI、CMDI评分均降低(P<0.05)；
柳氮磺吡啶组与芍药汤高、中、低剂量组DAI、CMDI评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 各组大鼠DAI、CMDI评分比较(分)
2.2 各组大鼠结肠组织p-PERK、CHOP蛋白表达比较 见表2。与空白组比较，模型组、柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中、低剂量组p-PERK、CHOP蛋白表达均上升(P<0.05)；
与模型组比较，柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中、低剂量组p-PERK、CHOP蛋白表达均下降(P<0.05)；
与芍药汤低剂量组比较，柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中剂量组p-PERK、CHOP蛋白表达均下降(P<0.05)；
柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中剂量组p-PERK、CHOP蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠结肠组织p-PERK阳性表达见图1。
表2 各组大鼠结肠组织p-PERK、CHOP蛋白表达比较
图1 各组大鼠结肠组织p-PERK阳性表达(免疫组化染色，×200)
2.3 各组大鼠结肠组织杯状细胞数量比较 见表3(图2)。与空白组比较，模型组、柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中、低剂量组杯状细胞数量均下降(P<0.05)；
与模型组比较，柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中、低剂量组杯状细胞数量均明显增加(P<0.05)；
与芍药汤低剂量组比较，柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中剂量组杯状细胞数量均增加(P<0.05)；
柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中剂量组杯状细胞数量比较无统计学差异(P>0.05)。
表3 各组大鼠结肠组织杯状细胞数量比较(个)
图2 各组大鼠结肠组织杯状细胞(PAS染色，×200)
前期研究发现，UC大鼠PERK信号通路被激活，大鼠结肠组织中p-PERK蛋白和p-PERK mRNA，p-eIF2a蛋白和p-eIF2a mRNA均增高[17]，引起核因子-κB(NF-κB)炎性通路激活，刺激促炎因子的分泌，引发UC。同时研究发现，PERK通路是诱导细胞凋亡的重要途径[18]。肠道上皮组织是人体最活跃的自我更新组织，其中 GC内质网结构发达，是肠黏液屏障的重要组成部分。当UC发生时，内质网发生应激，PERK信号通路激活，增加CHOP的表达，诱导细胞凋亡，使GC数量减少，结构被破坏，肠黏膜屏障损伤。西医治疗UC的药物主要有激素、水杨酸类、免疫抑制剂、生物制剂、抗菌药物等，还有其他新兴治疗如微生态制剂、粪菌移植等。临床实践中，长期的药物治疗不仅使耐药性大大增加，而且不良反应较多，病情易复发，价格昂贵，难以作为患者的长期选择[19]。
UC在中医无明确病名，根据症状可将其归于“久痢”“肠澼”范畴。UC多因外感时邪、饮食不节、情志内伤、素体肝肾不足所致，病位在肠，涉及脾、肝、肾、肺诸脏[20]。芍药汤出自《素问病机气宜保命集》，可清热燥湿、调气和血，方中以黄连、黄芩为君，清热泻火祛湿。重用芍药和营养血，行血则便脓自愈，配以当归养血止血。槟榔、木香调气则后重自除。大黄苦寒沉降，通因通用，使湿热随大便而下。肉桂辛热温通，助归、芍行血和营，为佐助。炙甘草调和诸药，缓急止痛。诸药合用，共奏清热燥湿、调和气血之效，使便脓自愈。
在本次研究中，柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中、低剂量组大鼠DAI、CMDI评分较模型组降低，说明柳氮磺吡啶及芍药汤均能减轻UC大鼠的症状。与模型组比较，柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中、低剂量组p-PERK、CHOP蛋白表达均降低，芍药汤低剂量组p-PERK、CHOP蛋白表达降低程度相较于柳氮磺吡啶组、芍药汤中剂量组及芍药汤高剂量组小，说明柳氮磺吡啶及芍药汤不同剂量组均能减少p-PERK、CHOP蛋白表达，但芍药汤低剂量组抑制作用较低，这可能是芍药汤药物浓度的影响。与模型组比较，柳氮磺吡啶组和芍药汤高、中、低剂量组杯状细胞数量均上升，芍药汤低剂量组杯状细胞数量相较于柳氮磺吡啶组、芍药汤中剂量组及芍药汤高剂量组小。柳氮磺吡啶及芍药汤不同剂量组均能使杯状细胞数量增加，但芍药汤低剂量组作用较差，从而猜测芍药汤可能是通过控制PERK信号通路被激活，减少CHOP表达，抑制杯状细胞凋亡，从而改善UC大鼠的症状和体征，这可能是芍药汤治疗UC的作用机制。
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