吕 婧，王玉玲，刘恩鹏，薛德娜，姜爱芳*
1.潍坊市中医院(山东 潍坊 261000) 2.潍坊医学院附属医院生殖医学中心(山东 潍坊 261042)
在过去的几十年中，人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART)得到了飞速发展，体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)也得到了快速发展和广泛临床应用[1]，但胚胎移植后的临床妊娠率只有40%～50%[2]。相比之下，反复种植失败(repeated implantation failure，RIF)成为了人类生殖领域的主要挑战，在IVF-ET中的发生率达10%[3]。RIF的根本原因是复杂的，无法与机体特定的异常相关联，主要影响因素包括以下几个方面：子宫结构异常、激素紊乱、免疫学因素、血栓形成和感染等，最终导致RIF的机制可能是多个因素、多种细胞因子共同作用的结果。然而能被现有机制解释的RIF约占50%，仍有近一半的RIF患者没有确切病因。植入的成功主要取决于母体与半同种异体胚胎局部免疫耐受机制的形成，该机制需要一系列细胞因子的相互作用来完成。细胞因子在妊娠的各个阶段中都起着重要的作用，尤其是胚胎着床和胚胎发育的早期[4]。相关研究表明[5]自然杀伤(natural killer,NK)细胞诱导的免疫逃逸机制在胚胎种植中具有重要影响，但淋巴细胞参与的母体妊娠免疫耐受形成是胚胎植入是否成功的关键。其中尤以辅助性T细胞(Th)为代表的T淋巴细胞的募集在胚胎植入过程中起着关键的作用。本实验采用免疫组化的方法，主要探究TNF-α、IL-10在子宫内膜组织中的表达以及TNF-α、IL-10比例是否存在失衡现象，进一步探究以TNF-α/IL-10为代表的Th1/Th2失衡与不明原因RIF的关系。为不明原因RIF的发生机制、诊疗提供新的思路。
1.1一般资料选取2019年3月-2019年9月于潍坊医学院生殖医院就诊的患者63例，其中因不明原因反复胚胎种植失败者33例作为实验组，于月经期1～2 d行子宫内膜活检；
既往曾于月经期1～2 d行子宫内膜活检且病理无异常患者30例作为对照组。实验组共纳入33例，纳入标准：①年龄≤35岁；
②月经规律、卵巢功能正常；
③符合2005年欧洲人类生殖医学与胚胎学会(ESHRE)提出的定义：经历3次以上优质胚胎或多次移植胚胎数量共计≥10枚依然未能妊娠；
④双方染色体正常；
⑤子宫内膜活检前均取得患者知情同意。排除标准：①感染、生殖系统畸形、内分泌紊乱、输卵管积水、卵巢反应不良等因素导致的RIF；
②优生全项IgM阳性；
③自身抗体阳性；
④凝血、血常规异常；
⑤女方全身或者局部严重的免疫系统疾病。对照组共纳入30例，纳入标准：①年龄≤35岁；
②月经规律、卵巢功能正常；
③双方染色体正常。两组患者均于月经期1～2 d行子宫内膜活检，且活检当天收集两组年龄、体质量指数(BMI)、月经周期、基础窦卵泡数目(AFC)、基础抗缪勒管激素(AMH)、基础卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)等一般资料。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。
表1 两组一般资料比较
1.2方法
1.2.1 主要试剂 TNF-α、IL-10一抗，二抗，免疫组化试剂盒均购于武汉博士德公司；
DAB显色试剂盒购于北京中山金桥公司；
抗原修复液(EGTA)购于福建迈新公司。
1.2.2 检测步骤 采用免疫组织化学染色方法检测两组子宫内膜组织中TNF-α、IL-10的表达。子宫内膜活检后病理标本常规脱水、包埋，切片，①二甲苯脱蜡、水化；
②EGTA微波炉抗原修复；
③滴加一抗，4℃过夜；
④滴加二抗；
⑤DAB显色；
⑥苏木素复染，返蓝，脱水，二甲苯透明；
⑦中性树胶封片。
1.3评价标准根据镜检组织切片染色结果进行判定。显微镜下TNF-α、IL-10主要定位于子宫内膜腺体细胞和间质细胞的胞质及胞膜，以免疫染色出现黄色或至棕褐色颗粒为阳性。阳性信号为黄色、棕黄色、棕褐色，根据阳性信号的强弱分为弱、中、强三级，并分别计分：阴性为0分，弱为1分，中为2分，强为3分。根据染色阳性细胞所占比例划分，阴性为0分，阳性范围<25%为1分，阳性范围25%～50%为2分，阳性范围50%～75%为3分，阳性范围：75%～100%为4分，上述评分相乘作为每例的总分。
2.1两组TNF-α、IL-10在子宫内膜组织中的表达TNF-α、IL-10在两组子宫内膜组织中均有表达，主要表达于EGC与ESC的胞质与胞膜中，染色阳性表达呈黄色至棕褐色(见图1)；
实验组TNF-α表达高于对照组(P<0.05)；
IL-10表达低于对照组；
实验组TNF-α/IL-10比值显著高于对照组(P<0.05)，见表2。
注：a：TNF-α在实验组表达；
b：TNF-α在对照组表达；
c：IL-10在实验组表达；
d：IL-10在对照组表达。
表2 TNF-α、IL-10在子宫内膜组织中的表达
2.2 TNF-α、IL-10相关性分析经Pearson相关性分析：实验组子宫内膜组织TNF-α、IL-10呈负相关(r=-0.443，P<0.05)；
对照组TNF-α、IL-10无相关性(r=0.163，P>0.05)，见表3。
表3 TNF-α、IL-10相关性分析
TNF-α是炎症的中枢调节因子，与胚胎植入，胎盘生长以及妊娠结局都有一定的关系。TNF-α作为Th1型细胞因子的一种，在整个孕妊期间呈增加的趋势，并且与复发性流产(Recurrent Spontaneous Abortion,RSA)、早期流产、先兆子痫和早产以及IL-10减少有关[6]。据报道[7]与正常妊娠妇女相比，RSA患者血清中TNF-α、INF-γ、IL-6和整体白细胞水平升高。研究表明[8]TNF-α低水平可以认为是试管婴儿成功的可靠预测。TNF-α在胚胎植入初始阶段起着非常重要的作用，能够诱导蜕膜化过程中T淋巴细胞的聚集，为母胎免疫界面的建立提供初始动力。当TNF-α表达过高时，通过负反馈机制抑制子宫内膜蜕膜化，并且能够产生放大作用引起相关Th1型细胞因子分泌的增加，产生细胞毒性作用；
TNF-α表达过高还可以改变体内甾体激素与受体的结合并诱导细胞凋亡机制的产生，导致肾上腺皮质分泌增加活化基质金属蛋白酶(MMPs)，进一步损伤胚胎滋养细胞的外基质，使得相关蛋白质发生功能的改变，进一步协同作用引发早期妊娠丢失。本实验中，实验组TNF-α高表达，表明TNF-α与不明原因RIF之间具有一定的关系，进而推测出TNF-α所代表的Th1型细胞因子与不明原因RIF有一定的关系，其结果表明Th1型细胞因子在不明原因RIF患者子宫内膜组中整体水平可能是增加的。
IL-10作为一种广泛的免疫抑制细胞因子在妊娠期间存在于各种组织和体液中，包括胚胎干细胞和合体滋养层细胞以及蜕膜组织中所分泌的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞，均能在胚胎发育早期、妊娠早期自发分泌IL-4和IL-10[9]，IL-10由Th2细胞分泌，并认为Th2细胞的存在是成功妊娠的必要条件[10]。正常妇女的羊水和母体血清中也发现了高水平的IL-10[11]。Ahmadi M等[8]研究表明，IL-10是诱导母体界面免疫耐受的重要细胞因子，可以诱导胚胎滋养细胞表达人类白细胞抗原-G(HLA-G)分子，HLA-G分子表达的增加能够降低细胞毒性T细胞的分泌，在胚胎种植和维持妊娠中发挥重要作用。Koushaeian L等[12]研究发现IL-10具有预防多种免疫细胞产生炎症反应的能力，产生IL-10的淋巴细胞群可以通过其配体机制调节植入过程中的免疫反应，并控制浆细胞中自身抗体的产生从而使胚胎成功植入，但是IL-10下调可影响胚胎种植，进一步导致RIF。本实验中，实验组IL-10低表达，表明IL-10与不明原因RIF具有一定的关系，进而推测出IL-10所代表的Th2细胞与不明原因RIF有一定的关系，在RIF中整体可能是减少的。
研究表明TNF-α或IL-10的变化与RIF存在关联[13]，并认为在IVF-ET中出现的RIF患者中，植入失败是由于Th1型细胞因子相对于Th2、Th3型细胞因子的分泌过盛，进一步推测认为在胚胎种植和妊娠期间TNF-α和IL-10的作用似乎是拮抗性，其性质可能取决于它们之间的平衡。母体子宫内膜及胚胎滋养层都能产生这两种细胞因子，母胎免疫平衡在植入中和胎盘中起主要作用。TNF-α/IL-10失衡是导致妊娠早期和晚期并发症的重要影响因素，特别是在胚胎植入失败、早期流产、反复早期自然流产、妊高征、先兆子痫、早产和妊娠期糖尿病等[14]都具有一定的影响。而将这两种细胞因子一起用来研究不明原因RIF的相关文献极少。本实验中，实验组TNF-α高表达、IL-10低表达，实验组中TNF-α/IL-10比值显著高于对照组(P<0.05)，均表明TNF-α/IL-10失衡与不明原因RIF之间具有一定的关系，且TNF-α与IL-10之间也具有相关性，进一步说明其对不明原因RIF的影响。从而也推测出TNF-α代表的Th1型细胞因子与IL-10细胞代表的Th2型细胞因子均与不明原因RIF具有一定的关系，Th1/Th2细胞比例失衡可能与不明原因RIF之间也具有一定的关系。
综上所述，子宫内膜组织中TNF-α高表达、IL-10低表达导致TNF-α/IL-10比例失衡从而引起胚胎种植障碍，是不明原因RIF的重要因素之一，但其具体的作用机制仍需进一步研究证实。
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