程映杰， 李 敏， 朱慧森， 岑慧芳， 郭 鹏
(山西农业大学草业学院， 山西 太谷 030801)
草地补播是在不破坏或少破坏原生植被的条件下，通过人为播种适应当地草地生态系统的优良草种，以达到改善牧草质量、提高草地生产力以及改良恢复退化草地等目的的重要途径[1-2]。草地早熟禾(Poapratensis)在我国分布广泛，常以建群种或伴生种见于草甸和草原及其它冷湿生境，具有繁殖能力强、绿色期长、抗旱抗寒等特点[3]。草地早熟禾不仅是重要的草坪草资源、饲草资源，而且在草地建设、生物多样性维护及生态修复中发挥着极其重要的作用[4]。已有研究表明草地早熟禾凋落物能够对同生境其他草种的种子萌发产生影响[5]，李志华[6]在对草地早熟禾及其他几种植物化感作用初步探究中指出，不同浓度草地早熟禾茎叶提取液对紫花苜蓿(Medicagosativa)和多年生黑麦草(Loliumperenne)等的生长存在促进或抑制的化感效应。本团队前期研究也发现草地早熟禾叶和根茎浸提物对百日草(Zinniaelegans)、孔雀草(Tagetespatula)等植物种子发芽具有抑制作用[7]，并证实香豆素是草地早熟禾的主要化感物质[8]。
大量的生产实践及试验表明，化感物质通过改变植物细胞膜的通透性，影响植物细胞的分裂、生长、分化，干扰蛋白质、激素的合成和平衡等途径，对一些植物种子的萌发、幼苗生长以及干物质的积累等产生影响[9-11]。香豆素最早是在豆科植物香豆(Dipteryxodorata)中提取，结构上是顺式邻羟基桂皮酸分子内脱水而成的内酯，属于苯并ɑ-吡喃酮，分布在多种植物的根、茎、叶等器官中[12]，能够调节植物的生长发育[13]，改善根系微生物群落结构，以及作为化感物质释放到环境中对其他植物种子的萌发和幼苗生长产生影响[14]。
本研究选择北方温性灌草丛类草地常见的达乌里胡枝子、白羊草、二月兰、草地早熟禾作为研究材料[15-16]，达乌里胡枝子、草地早熟禾被报道作为伴生种存在于华北天然白羊草草地，二月兰在华北地区常见，可以安全越冬，并能作为绿肥改良土壤理化性质[17]。通过研究草地早熟禾主要化感物质-香豆素对6种材料种子萌发、生长的影响，筛选以草地早熟禾为主的草地适宜补播的材料，为维持草地植物群落的稳定性、物种多样性，加快恢复退化草地，修复生态环境提供新的思路。
1.1 试验材料
‘晋农1号’达乌里胡枝子、‘太行’白羊草为自主选育的品种，由山西农业大学草类种质资源库提供。二月兰和草地早熟禾‘珠峰’、‘幸运星’、‘新歌莱德’均购自北京绿冠有限公司。
1.2 试验方法
依据前期从草地早熟禾的叶片与根茎中所测得香豆素含量[8]，设置香豆素溶液浓度梯度为0，20，40，60，80和100 μg·mL-1。香豆素标品购自索莱宝科技有限公司。
使用1%的H2O2对6种材料的种子消毒1 min，蒸馏水反复冲洗干净，在直径为9 cm的培养皿中铺两层滤纸，每皿均匀摆放50或100粒种子(二月兰50粒，其余种子摆放100粒)，吸取5 mL不同浓度的香豆素溶液分别加入培养皿中，用蒸馏水作为对照，各处理设置3次重复，于25℃下恒温培养，12 h光照/12 h黑暗，湿度为60%～80%，每2 d称重，并向培养皿中补充蒸发损失的蒸馏水，保持滤纸湿润。
参照《国际草种子检验规程》[18]测定发芽势与发芽率，以胚根长度超过种子长度的1/2视为种子发芽，每24 h记录发芽情况。结束发芽后用游标卡尺(精确度为0.01 mm)测量茎和根的长度，用电子天平(精确度为0.1 mg)称量幼苗的鲜重，各处理测定30株。各测量指标的计算公式如下：
发芽势(Germination potential，GP)=发芽试验规定时期内正常发芽种子数/供试种子数×100%(达乌里胡枝子以3天计，白羊草以7天计，二月兰以5天计，珠峰、幸运星和新歌莱德以10天计)。
发芽率(Germination rate，GR)=种子发芽总数/供试种子总数×100%。
发芽指数(Germination index，GI)=∑(Gt/Dt)(Gt为t日发芽数，Dt为相应的天数)。
活力指数(Seed vigor index，SVI)=GI×S，GI为发芽指数，S为发芽结束测得的整株幼苗鲜重(g)。
参照Williamson和Richandson[19]的方法计算综合化感效应指数(SE)。
化感效应指数(Allelopathic response index，RI)=(Ti-T0)/T0×100%，式中，Ti为处理值，T0为对照值。
综合化感效应指数(Synthetic effect of allelopathy，SE)：同一供试植物的发芽势、发芽指数、根长、芽长、幼苗鲜重、活力指数的RI的算术平均值。其中，RI或SE为正值时表示促进作用，RI或SE为负值时表示抑制作用，绝对值大小表示影响的强弱。
1.3 数据处理
使用Excel 2013整理数据，SPSS 26.0对数据统计分析，Duncan’s法进行组间差异显著性检验(P<0.05)，所得结果均以平均值±标准误表示，用Origin 2019b作图。
2.1 不同浓度香豆素溶液对6种材料种子萌发的影响
由表1可知，随香豆素溶液浓度的升高，6种材料种子的发芽势、发芽率、发芽指数趋于受抑制。从发芽势看，随着香豆素浓度的升高，达乌里胡枝子、二月兰与‘新歌莱德’的发芽势逐渐降低，而‘幸运星’、‘珠峰’的发芽势的变化呈现“低促高抑”的效果。达乌里胡枝子在40 μg·mL-1香豆素处理下发芽势较对照降低了26.90%，且差异显著(P<0.05)；
白羊草在80 μg·mL-1香豆素处理下发芽势较对照降低了12.51%，差异显著(P<0.05)；
在20 μg·mL-1香豆素处理下，‘幸运星’发芽势显著高于对照，增加了45.84%。从发芽率看，低浓度(20 μg·mL-1)的香豆素能够提高达乌里胡枝子、白羊草、‘幸运星’、‘珠峰’的发芽率；
达乌里胡枝子在20 μg·mL-1香豆素处理下发芽率增加了4.08%，显著高于对照(P<0.05)；
白羊草在40 μg·mL-1香豆素处理较对照增加28.88%，且存在显著差异(P<0.05)。从发芽指数看，20 μg·mL-1香豆素处理下能提高达乌里胡枝子、白羊草、‘幸运星’、‘珠峰’的发芽指数，处理浓度为40 μg·mL-1时，白羊草的发芽指数较对照显著增加26.47%(P<0.05)。
表1 香豆素溶液对6种材料发芽势、发芽率与发芽指数的影响Table 1 Effects of coumarin solution on germination potential,germination rate and germination index of six materials
2.2 不同浓度香豆素溶液对6种材料根长、芽长的影响
由表2可知，不同浓度香豆素对达乌里胡枝子根生长表现为促进作用，达乌里胡枝子在20 μg·mL-1香豆素处理下，根长较对照增加了80.50%，差异显著(P<0.05)；
‘幸运星’在香豆素浓度为100 μg·mL-1时根的生长受显著抑制(P<0.05)，相比对照降低了49.37%。从芽长变化来看(表2)，不同浓度香豆素处理下，达乌里胡枝子、白羊草、‘幸运星’芽生长所受影响表现为“低促高抑”，二月兰与‘珠峰’芽生长表现为受抑制。在100 μg·mL-1香豆素处理下，达乌里胡枝子芽生长受抑制，较对照降低了24.73%。
表2 香豆素溶液对6种材料根长与芽长的影响Table 2 Effects of coumarin solution on root length and bud length of six materials
2.3 不同浓度香豆素溶液对6种材料鲜重与活力指数的影响
由表3可知，不同浓度香豆素处理下，达乌里胡枝子、白羊草、幸运星的鲜重变化呈“低促高抑”，珠峰与新歌莱德鲜重较对照显著降低；
达乌里胡枝子在20 μg·mL-1香豆素处理下鲜重显著增加(P<0.05)，较对照增加了13.33%；
白羊草在香豆素处理浓度为40 μg·mL-1时，鲜重相比对照高出5.88%，差异显著(P<0.05)。从活力指数变化来看，达乌里胡枝子、白羊草的活力指数在低浓度香豆素处理下受到促进作用，高浓度(100 μg·mL-1)香豆素处理显著降低6种材料的活力指数。达乌里胡枝子在20 μg·mL-1香豆素处理下，活力指数显著升高(P<0.05)，相比对照增加了13.78%，而香豆素处理浓度为40 μg·mL-1时，达乌里胡枝子活力指数较对照显著降低了9.73%；
白羊草活力指数在40 μg·mL-1香豆素处理下显著高出对照34.97%(P<0.05)，在80 μg·mL-1香豆素处理下较对照降低了13.29%，且与对照存在显著差异(P<0.05)。
表3 香豆素溶液对6种材料鲜重与活力指数的影响Table 3 Effects of coumarin solution on fresh weight and vigor index of six materials
2.4 香豆素对6种材料的综合化感效应
由图1可知，不同浓度香豆素对6种材料的化感作用效果、作用强度存在差异。从作用效果来看，在不同浓度香豆素处理下，达乌里胡枝子、白羊草、‘幸运星’、‘珠峰’种子萌发及幼苗生长所受化感效应呈现“低促高抑”的效果；
二月兰与‘新歌莱德’受化感抑制作用，且随香豆素浓度升高，抑制作用加强。从作用强度看，20 μg·mL-1香豆素处理下，受化感促进作用由强到弱的4种材料依次为：达乌里胡枝子、白羊草、‘幸运星’、‘珠峰’；
40，60 μg·mL-1香豆素处理下，仅有白羊草受化感促进作用，其余5种材料均受不同程度的化感抑制作用；
当香豆素处理浓度升高至80 μg·mL-1时，6种材料均受到化感抑制作用，抑制程度由强到弱依次为：‘新歌莱德’、二月兰、‘幸运星’、‘珠峰’、达乌里胡枝子、白羊草；
在100 μg·mL-1香豆素处理下，6种材料种子受化感抑制作用程度由强到弱依次为：‘新歌莱德’、‘幸运星’、‘珠峰’、二月兰、达乌里胡枝子、白羊草。
图1 不同浓度香豆素溶液对供试材料综合化感效应指数的影响Fig.1 Effects of different concentrations of coumarin solution on the comprehensive allelopathy index of tested materials
草地补播操作简便、见效快，是改良退化草地有效途径[20]。依据草地类型，选择适宜的草种补播，可以明显改善草地的生产力，提高草地抵抗杂草入侵的能力。但实际补播过程中，补播的效果由多方面因素影响，化感效应便是其中之一。原有草地群落植物的化感作用强度直接影响后续补播材料的萌发生长，通过化感作用评定筛选适应当地草地类型的补播材料具有重要意义。
香豆素作为草地早熟禾主要的化感物质，对6种材料的作用效果存在差异。种子萌发是植物生长周期中最脆弱且最重要的阶段，发芽率降低、发芽时间的延长以及出苗延后，会影响植物在生态系统中的竞争能力[22]。在本研究中，从发芽率、发芽势、发芽指数来看，低浓度(20 μg·mL-1)香豆素溶液处理下，达乌里胡枝子、白羊草、‘幸运星’、‘珠峰’种子萌发受到促进作用，而随香豆素浓度梯度升高，对6种材料种子萌发均呈现抑制效果。已有研究表明，香豆素在40 μg·mL-1时能显著抑制多花黑麦草(Loliummultiflorum)、萹蓄(Polygonumaviculare)、红三叶(Trifoliumpratense)、紫花苜蓿‘维多利亚’的种子萌发和幼苗生长，而对籽粒苋(Amaranthushypochondriacus)种子萌发呈现促进效果[23]。低浓度条件下香豆素对达乌里胡枝子、白羊草、‘幸运星’、‘珠峰’萌发的促进作用可能是其水溶液略显酸性的结果，引起细胞壁的松弛，有利于种子的萌发和破壁生长[24]。随处理浓度升高，香豆素可通过改变细胞膜通透性，影响线粒体呼吸、酶活性和蛋白质的合成等途径抑制和延缓6种材料种子的发芽过程[25-26]。
从根长、芽长、鲜重、种子活力指数的变化趋势来看，6种材料幼苗根与芽的生长随香豆素浓度的升高最终表现为受抑制。达乌里胡枝子、白羊草、‘幸运星’在20 μg·mL-1香豆素处理下，鲜重、种子活力指数高于对照，可能是在该浓度下，这3种材料种子通过大量吸水进行调节从而缓解香豆素的作用，而高于20 μg·mL-1香豆素可能超出了6种材料自身可调节的范围，对幼苗造成损伤[24]。研究表明，0.5 μg·mL-1香豆素溶液促进紫花苜蓿根的生长，而高于50 μg·mL-1的香豆素溶液降低了紫花苜蓿的根尖和根缘细胞的活性，抑制紫花苜蓿根系生长[27]。陶茸认为低浓度香豆素可能诱导植物根冠PME基因的表达，促进了根缘细胞的形成，通过根缘细胞释放某些生物活性物质，中和化感物质的毒性。但化感物质浓度高于根尖组织耐受极限则会抑制植物根系的生长[27]。本研究中低浓度(20 μg·mL-1)香豆素溶液极显著促进达乌里胡枝子根生长，对白羊草、‘幸运星’根系生长也有一定的促进效果，高浓度香豆素均抑制6种材料的根生长，表明6种材料根系受香豆素影响存在差异，低浓度处理下，达乌里胡枝子根系对香豆素毒性的敏感程度远低于其他5种材料。推测香豆素直接作用于幼苗根系，对根系细胞造成破坏，影响根系对水分和养分的吸收能力，从而使根与芽的生长延缓甚至停滞。
从综合化感效应看，低浓度(20 μg·mL-1)香豆素溶液处理下，受化感促进作用最显著的是达乌里胡枝子，其次是白羊草。香豆素处理浓度增加至40 μg·mL-1时，对白羊草的化感促进作用最显著，而其他5种材料均受到不同程度的抑制作用。一般来说根际土壤中化感物质含量要远低于植株[28]，因此香豆素在土壤中的实际浓度可能远低于本研究中达乌里胡枝子、白羊草种子萌发与幼苗生长受抑制的最低浓度，所以推测达乌里胡枝子、白羊草可能适宜作为补播材料。同时，补播不仅仅要考虑种子萌发情况，更要保证后期群落稳定性。豆禾生态位的差异往往利于其共生，已有报道称达乌里胡枝子与白羊草混播利于提高水分胁迫下二者叶片光合速率与水分利用效率[29]。草地早熟禾与白羊草同为根茎疏丛型下繁草并占据相同的生态位，有研究证实，陕北黄土丘陵区撂荒地与黄土丘陵沟壑区滑坡堆积体的植被演替中，均出现包含白羊草、达乌里胡枝子与早熟禾的群落[30-31]，并且在天然白羊草草地中达乌里胡枝子与草地早熟禾作为伴生种存在[32]，进一步验证达乌里胡枝子与白羊草可以作为补播材料的推论，并推测达乌里胡枝子、白羊草、草地早熟禾之间可以多种组合方式混播。
不同浓度(0～100 μg·mL-1)的香豆素对二月兰的的化感效应始终表现为抑制，推测二月兰不宜作为补播材料。较低浓度(40 μg·mL-1)香豆素处理下3个品种草地早熟禾萌发均受到抑制，前人研究发现，草地早熟禾与冷地早熟禾的浸提液对其自身种子萌发和幼苗生长均有抑制作用[8,33]，表明草地早熟禾之间也存在较强的竞争。草地早熟禾通过对同生境下的其他植物的化感作用，以及对自身的自毒作用来维持种群的适当密度，占据更多的生存空间[34]。为避免其对自身的化感作用降低草地早熟禾草地质量，应重点考虑补播方式、补播密度。
本研究用草地早熟禾主要化感物质对6种材料进行萌发特性评定，为后续补播试验提供更佳的草种选择，降低了进一步验证补播可行性试验的工作量。适宜的材料组合是提高补播效益的关键，通过筛选以草地早熟禾为主导的草地适宜补播的材料，以构建稳定的草地群落，改善土体结构，加快演替进程，为北方干旱半干旱地区增绿的同时，充分发挥草地生态系统对二氧化碳等温室气体的吸收功能，助力碳达峰碳中和计划如期完成[35]。
香豆素对6种材料种子萌发及幼苗生长具有化感效应，对‘晋农1号’达乌里胡枝子、‘太行’白羊草、草地早熟禾‘幸运星’与‘珠峰’的化感作用表现为“低促高抑”，对二月兰、‘新歌莱德’表现为抑制作用；
20 μg·mL-1和40 μg·mL-1的香豆素溶液分别对‘晋农1号’达乌里胡枝子、‘太行’白羊草种子萌发与幼苗生长产生较强的化感促进效果，结合草地早熟禾与达乌里胡枝子、白羊草可在天然草地共生，推断所选材料中，‘晋农1号’达乌里胡枝子、‘太行’白羊草是比较理想的草地早熟禾为主导的草地补播材料。本研究仅通过化感作用探讨适宜用作补播的草种，而补播方式、补播时间等影响补播效果的因素尚进一步探究。