李春玥， 马 飞， 杨高文， 刘 楠， 张英俊
(中国农业大学草业科学与技术学院， 北京 100193)
草地是牧民维持生计的重要物质基础，是发展畜牧业的重要保障[1]，同时也是我国重要的生态屏障。但是由于过度放牧、人为的不合理利用以及气候条件等因素，导致草地生态系统退化、物种多样性损失、牧草品质下降[2-3]、草畜矛盾激化等[3]。目前，我国约90%天然草原处于不同程度的退化之中，其中重度退化草原占60%以上[3-4]，因此，退化草地的恢复和改良迫在眉睫[5]。草地免耕补播是更新、复壮草群的有效措施之一，通过在退化草地中免耕补播适宜的优良草种，解除了种子限制，在不扰动或少扰动原生植被的前提下，增加草原植被覆盖度、物种多样性，从而提升退化草原生产力并提高牧草质量[6-8]。
在采用补播措施对退化草地进行修复的过程中，应选择适宜的植物作为补播物种[8]。在退化草地中补播豆科植物能够发挥植物本身的固氮作用，使豆科牧草具有较高的粗蛋白含量，有助于提高草地的生产力和牧草品质；
此外，豆科植物具有水分利用率高、凋落物含氮量高等优点，有助于提高植物群落对干扰的抵抗力、改善土壤碳氮循环和增加土壤肥力等优点[9-12]。黄花苜蓿(Medicagofalcate)作为天然草地补播的优良豆科牧草[13]，具有较多的水平根，单株覆盖面积大，且抗寒抗旱性强，能够提高天然草地的生产力[14]、改善牧草品质[15]、影响群落结构和提升物种多样性[14]。
施肥作为草地管理的重要手段，对于草地生态系统生产力的维持极为重要。有研究表明，施加氮肥能在短期内提高草地生产力[16]，在退化草地群落中施加氮肥提高了多年生根茎禾草的生产力和优势度，但物种丰富度略有下降[7]。Zhou等[17]研究表明，施加磷肥促进豆科牧草的建植，提高了紫花苜蓿(Medicagosativa)和黄花苜蓿的生物量，维持植物群落多样性的同时提高了植物生产力，从而促进了退化草原的恢复。退化草地植物群落对施肥的响应与退化程度、植物物种种类和土壤理化性质等有关[18]，不同植物物种对施肥的响应有所差异。此外，施肥不仅会影响地上植物群落的多样性和生产力，也会对土壤微生物结构和功能产生显著影响[19-20]。同时，我国磷资源面临短缺，过量施用磷肥会造成土壤污染等不利影响[21]。
土壤微生物在草地生态系统中占有重要的地位[22]，如丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)和根瘤菌(Rhizobium)等植物共生菌能够促进植物生长。AMF能够与80%以上的维管植物共生，对于提高植物养分吸收、增强植物的抗逆性、改善土壤结构、促进幼苗定植以及影响物种间的相互作用具有重要作用，进而能够提高草原生产力和改变植物多样性[23-25]。然而，有研究表明不同植物对AMF的菌根依赖性不同，多年生暖季型C4禾草和非禾草的菌根响应积极，而冷季型C3禾草接种AMF后无显著影响[26]。根瘤菌作为自然界中常见的微生物，能与豆科植物形成共生关系，为宿主植物提供氮素，提高草地生产力，是群落中豆科植物维持的关键因子[27]。因此，在草原的补播修复过程中，接种植物共生菌可能有助于豆科牧草的建植。已有研究发现，豆科植物进行根瘤菌和AMF双接种比单接种的生长表现和抗病能力更好，并且在有AMF的情况下豆科植物的结瘤数目增加[28-29]。此外，Zhou等[30]研究发现，根瘤菌和AMF双接种对植物群落生产力和豆科植物的生长和结瘤有明显的促进作用。基于以上研究，我们提出能否利用接种植物共生菌替代施肥促进补播群落中黄花苜蓿的建植？
为回答这一科学问题，本研究选取天然草原羊草(Leymuschinensis)和冷蒿(Artemisiafrigida)作为禾本科和杂类草代表物种，以黄花苜蓿作为补播豆科植物代表物种。通过室内盆栽试验来研究三种代表物种对接种植物共生菌或施肥的响应，并探究接种植物共生菌或施肥处理对补播植物群落生产力以及群落结构的影响。我们的研究结果将为草地补播改良技术提供科学根据。
1.1 试验设计
采用室内盆栽试验，选取羊草、冷蒿和黄花苜蓿三种不同功能群植物物种构建补播群落。采用两因素析因试验设计，其中接种共生菌包括4个水平:不接种(-AMF-R)、接种根瘤菌(-AMF+R)、接种丛枝菌根真菌(+AMF-R)和双接种(+AMF+R)，施肥包括4个水平:对照(CK)、添加氮(N)、添加磷(P)和氮磷同施(NP)。共16个处理，每个处理重复5次，共80盆。
1.2 试验材料
1.2.1种子采集及萌发 本试验所用羊草和冷蒿种子均采自内蒙古草甸草原，黄花苜蓿种子采自内蒙古呼伦贝尔海拉尔区谢尔塔拉牧场二队。种子采回后用10% H2O2处理10 min，去除种子表面可能存在的微生物。用蒸馏水洗净后，在灭菌石英砂中进行萌发培养，为保证水分充足，每隔3天浇水一次。
1.2.2培养基质准备与植物共生菌接种 于内蒙古呼伦贝尔海拉尔区草地农业生态系统试验站采集0～10 cm土层的土壤，并过2 mm筛。对于接种AMF的处理:将土壤与河沙以3∶1均匀混合后装入花盆(高:17 cm，直径:15 cm)，每盆2 kg。沙土培养基质全氮含量为0.29%，土壤速效磷含量为19 mg·kg-1。对于不接种AMF处理:将土壤装入灭菌袋，置于高温高压蒸汽灭菌锅(LS-50HV，江阴滨江医疗设备有限公司)中，在121℃下，灭菌60 min，并在24 h后用相同方法再灭菌一次，以保证灭菌效果；
对河沙也用上述方法进行灭菌，将灭菌土壤与灭菌河沙按照3∶1比例均匀混合后，每个花盆装入装2 kg，并加入70 mL除AMF外的土壤微生物滤液。微生物滤液的制备:将未灭菌土壤按土水比1∶2搅拌混合，用直径25 μm的筛子过滤，由于AMF孢子大于25 μm，过滤液不含AMF[31]。在接种AMF的花盆中加入70 mL水，以保证试验设计符合唯一差异性原则。试验所用根瘤菌由中国农业大学菌根小组提供，名称为中华苜蓿根瘤菌sm1021(Sinorhizobiummeliloti1021)。对于接种根瘤菌的处理，每盆接种4 mL根瘤菌液，于幼苗移栽后用移液枪将菌液注入黄花苜蓿根部。
1.2.3幼苗移栽培养与施肥处理 种子萌发约25天后进行移栽。每盆每种植物各移栽两株，共六株植物，随机均匀分布于一个花盆中。花盆在温室中随机排列，每15天换一次位置。温室白天温度为20～30℃，夜晚为15～25℃。每4天浇水100 mL，并于每周加入100 mL·盆-1改良过的McKnight营养液，每升该营养液含有:300 mg KCl;887 mg CaCl2;200.4 mg MgSO4·7H2O;0.22 mg ZnSO4·7H2O;0.079 mg CuSO4·5H2O;3.61 mg MnCl·4H2O;2.86 mg H3BO3;10.293 mg FeSO4·7H2O;0.144 mg NaMoO4·2H2O。根据Zhan等[32]在内蒙古草原的施肥试验研究，确定氮磷肥的添加量，用KH2PO4和NH4Cl分别进行氮磷养分的处理，氮养分添加量为26.17 mg·kg-1，磷养分添加量为14.57 mg·kg-1，氮磷同施为二者之和，该施肥量为中等施肥水平。氮磷添加分两次进行，每次添加一半，第一次添加在幼苗移栽初期，第二次在植株生长两个月后添加。
1.3 取样及测定
植物生长到4个月后，测定植物地上和地下生物量。从植物根部分种剪下，用于测定各植株的地上生物量。对于植物的地下部，将根系放入网筛缓慢冲洗干净，保存至4℃冰箱，用于测定根系菌根侵染率、苜蓿根部结瘤情况以及地下生物量。
1.4 统计分析
所有原始数据用Microsoft Excel 2016进行整理，用Shapiro.test函数进行正态分布检验，用线性模型(lm)进行双因素方差分析，检验接种植物共生菌、施肥处理以及二者交互作用对补播群落的地上生物量、菌根侵染率、群落生物量比例等指标的作用，采用Duncan法进行多重比较对不同共生菌接种和不同施肥处理下的指标在95%的置信区间上进行显著性分析。采用tidyverse进行数据操控，用ggplot2进行数据可视化，所有的数据分析和作图在R-4.1.3版本下进行。本研究所有的原始数据和R代码可以通过figshare获取(DOI:10.6084/m9.figshare.19711621)。
2.1 植物共生菌接种或施肥对补播群落植物生物量的影响
与不接种(-AMF-R)相比，接种AMF(+AMF-R)和双接种(+AMF+R)均显著降低了补播群落植物的总地上和地下生物量(图1，P<0.001)。与不接种(-AMF-R)相比，接种AMF(+AMF-R)与双接种(+AMF+R)时补播群落地上生物量显著降低了26.57%(P<0.001)，但接种AMF(+AMF-R)和双接种(+AMF+R)处理间群落的地上生物量无显著差异(图1a)。对于补播群落植物的地下总生物量，与不接种(-AMF-R)相比，接种AMF(+AMF-R)或双接种(+AMF+R)分别显著降低了31.90%和16.56%(P<0.001)；
在不接种(-AMF-R)，接种AMF(+AMF-R)与双接种(+AMF+R)处理下，施肥处理对补播群落的地下总生物量无显著影响(图1b)。
图1 植物共生菌接种或施肥对地上生物量和地下生物量的影响Fig.1 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the total aboveground and belowground biomass注:不同大写字母表示不同接种处理间差异显著(P<0.05)，不同小写字母表示不同施肥处理间差异显著(P<0.05)，下同；
***表示P<0.001；
**表示P<0.01；
*表示P<0.05；
ns表示P>0.05Note:Different capital letters indicate significant differences among different inoculation treatments at the 0.05 level;different lowercase letters indicate significant differences among different fertilization treatments at the 0.05 level,the same as below;***, P<0.001;**, P<0.01;*, P<0.05;ns,P>0.05
与-AMF-R相比，+AMF-R或+AMF+R使补播群落中黄花苜蓿的地上生物量分别显著增加了919.78%和945.06%(P<0.001)，但+AMF-R和+AMF+R间黄花苜蓿的地上生物量无显著差异；
在-AMF-R时，P与CK相比，黄花苜蓿的地上生物量显著提高了465.93%(P<0.001)，但在+AMF-R时，施肥对黄花苜蓿的地上生物量无显著影响；
在+AMF+R时，P与CK相比，黄花苜蓿的地上生物量仅显著提高46.58%(图2a，P<0.001)。与-AMF-R相比，补播群落中羊草的地上生物量在+AMF-R或+AMF+R时分别显著降低了60.66%和60.36%(P<0.001)；
在-AMF-R时，P与CK相比，羊草的地上生物量显著增加了34.49%(P<0.01)；
在+AMF-R时，P与CK相比，羊草地上生物量显著增加了36.49%(图2b，P<0.01)。与-AMF-R相比，+AMF+R时冷蒿的地上生物量显著提高了35.02%(P<0.001)；
但+AMF-R和+AMF+R处理间补播群落中冷蒿的地上生物量无显著差异；
在+AMF-R时，NP相比于其它施肥处理使冷蒿的地上生物量显著提高了129.39%(图2c，P<0.001)。
图2 植物共生菌接种或施肥对黄花苜蓿、羊草和冷蒿地上生物量的影响Fig.2 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the aboveground biomass of M. falcate,L. chinensis and A. frigida
2.2 植物共生菌接种或施肥对植物菌根侵染率的影响
施肥均降低了补播群落中三种植物的菌根侵染率。在+AMF-R时，NP与CK相比，黄花苜蓿的菌根侵染率显著降低了17.18%(P<0.05)；
在+AMF+R时，NP与CK相比，黄花苜蓿菌根侵染率显著降低了15.13%(图3a，P<0.05)。在+AMF-R时，P与CK相比，羊草的菌根侵染率显著降低了14.48%(P<0.05)；
+AMF+R时，P与CK相比，羊草的菌根侵染率显著降低了19.88%(图3b，P<0.05)。与CK相比，P和NP处理使冷蒿的菌根侵染率分别显著降低了12.11%和12.40%(图3c，P<0.01)。
图3 植物共生菌接种或施肥对黄花苜蓿、羊草和冷蒿菌根侵染率的影响Fig.3 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the mycorrhizal root colonization of M. falcata,L. chinensis and A. frigida
2.3 植物共生菌接种或施肥对黄花苜蓿结瘤的影响
与-AMF-R相比，-AMF+R、+AMF-R与+AMF+R时补播群落中黄花苜蓿的结瘤数分别提高了57.28%，345.63%和417.48%(P<0.001)，其中双接种的效果最好；
与CK相比，P和NP处理后黄花苜蓿的结瘤数量均分别显著增加了51.75%(表1，P<0.001)。与-AMF-R相比，+AMF-R和+AMF+R显著增加了黄花苜蓿的根瘤重(P<0.001)；
与CK相比，P和NP处理后黄花苜蓿的根瘤重显著增加了47.30%(P<0.01)。
2.4 植物共生菌接种或施肥对补播群落结构的影响
-AMF-R或-AMF+R时，黄花苜蓿在植物群落的占比为1.60%～1.80%，+AMF-R或+AMF+R时黄花苜蓿的地上生物量比例提高至22.10%～33.17%(图4)。-AMF-R或-AMF+R时，羊草生物量比例均在80%以上；
+AMF-R或+AMF+R时羊草的地上生物量比例下降为40.22%～57.20%；
且在+AMF-R或+AMF+R时，施肥对羊草地上生物量比例的影响不显著。与-AMF-R相比，-AMF+R处理对冷蒿的地上生物量比例无显著影响，而+AMF-R和+AMF+R使冷蒿地上生物量比例显著提高了150.40%(图4，表2，P<0.001)，但+AMF-R和+AMF+R间无显著差异；
在-AMF-R处理下，P与CK相比使冷蒿的地上生物量比例显著提高了86.87%(图4，表2，P<0.05)；
+AMF+R时，与CK相比，P或NP处理对冷蒿地上生物量比例的影响不显著。
表1 植物共生菌接种或施肥对黄花苜蓿 结瘤数和结瘤重的影响Table 1 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the number and weight of M. falcate root nodules
表2 植物共生菌接种或施肥对物种生物量比例的影响Table 2 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the plant biomass composition
通过研究植物共生菌接种或施肥如何影响补播豆科草地植物群落结构和生产力发现，接种AMF或双接种均显著降低了补播群落植物的地上和地下总生物量，主要是由于接种AMF或双接种显著增加了黄花苜蓿和冷蒿的生物量，而降低了羊草的地上生物量。原因可能是不同的植物种类与AMF建立的共生关系不同，前人研究表明，相比于C3禾草，豆科和杂类草的菌根依赖性更强[33]。并且在补播群落中植物会对共同利用的资源产生竞争，不接种植物共生菌时优势种羊草在生长速度和生物量等方面都高于黄花苜蓿和冷蒿，导致黄花苜蓿和冷蒿在资源竞争中处于劣势；
而接种AMF或双接种后显著增加了黄花苜蓿和冷蒿的地上生物量，减轻了优势种羊草对其他植物物种的竞争排除，帮助黄花苜蓿在补播群落中定植，并提高其在补播群落中所占比例，从而降低了羊草在补播群落中的优势性。
图4 植物共生菌接种或施肥对物种生物量比例的影响Fig.4 Effects of the inoculation of plant symbiotic microbes or fertilization on the composition of plant communities
研究发现，施加磷肥或氮磷同施均显著提高了补播群落的地上总生物量，这与Avolio等[34]研究结果一致。本研究中，在不接种共生菌时，施加氮肥对羊草和冷蒿的地上生物量无显著影响，施磷肥则显著提高了补播群落中羊草和冷蒿的地上生物量。有研究表明，豆科牧草由于生物固氮的功能，在低氮环境中更容易生长且对磷比较敏感[35]，这与本研究结果相符，即施加磷肥和氮磷同施均显著增加了黄花苜蓿的地上生物量，提高了黄花苜蓿在群落中的所占比例。此外，有研究表明，在长期施肥试验中，施加磷肥显著提高了草地的地上净初级生产力，同时改变了草地群落中功能群的组成[34]。
研究发现，与AMF建立共生关系后导致植物对施肥的响应发生改变。不接种时，与不施肥相比，施磷肥处理下黄花苜蓿的地上生物量显著提高了465.93%，而在双接种时，施磷肥与不施肥相比，黄花苜蓿的地上生物量仅显著提高了46.58%。AMF与植物的共生关系会受到土壤养分的影响，养分越高共生效果越差甚至会产生负效应来抑制植物生长[36]。本研究中，三种植物的菌根侵染率在施肥后均出现不同程度降低，说明施肥减弱了寄主植物与AMF的共生关系，在氮磷富集的土壤中，植物吸收养分不会过多的依赖AMF，寄主植物对AMF的依赖性降低，相应的减少了寄主植物分配给AMF的碳水化合物和脂肪酸，菌根侵染率也随之降低[37]，且随着土壤磷含量的增加，AMF对寄主植物的吸磷贡献率逐渐下降，说明土壤含磷量低时AMF对寄主植物益处越显著[38]。接种AMF后黄花苜蓿的根瘤数目和结瘤重显著高于未接种AMF，而且在施加磷肥时效果最好，即AMF能够促进根瘤的生长。原因可能是接种AMF后为根瘤固氮提供了充足的营养及铜、锌等微量元素，促进了根瘤菌的固氮能力[39-40]；
其次，根瘤菌和AMF接种后，刺激了黄花苜蓿对碳的需求，使黄花苜蓿具有更高的光合作用和呼吸速率，提高了寄主植物供给AMF的碳含量[41]。研究表明，双接种对寄主植物的促进作用要超过单接种，说明二者之间存在协同促进作用[42-43]，此外，Larimer等[44]人的研究同样说明了双接种对豆科的协同促进效应，这两类共生菌会对群落中豆科的优势度有显著的影响。但是在本研究中却显示，接种AMF与双接种对于补播豆科植物地上总生物量和黄花苜蓿地上生物量无显著差异，这与试验预期假设不一致，这可能是由于AMF的生长需要较高的光合作用和呼吸速率，从而抑制了根瘤菌的生长[41]。
在退化草地采用免耕补播进行修复时，当不接种植物共生菌时，施磷肥均能提高黄花苜蓿、羊草和冷蒿的地上生物量，但当接种AMF时，施磷肥对补播群落中黄花苜蓿的作用则会下降。通过接种AMF能够增加补播群落中黄花苜蓿的地上生物量，而降低羊草的地上生物量，从而提高黄花苜蓿的竞争力，有助于黄花苜蓿的补播建植以及补播后群落结构的维持。因此，考虑到我国磷资源的匮乏以及过度施用磷肥所产生的不利影响，可以通过接种AMF替代磷肥施用促进补播黄花苜蓿的建植。在未来的研究中，应该加强AMF菌株的筛选和开发，将AMF菌剂用黄花苜蓿的补播建植，为草地补播提供技术支持。
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