杨维英, 叶敏强，张丽，孔园园，张晓霞
(1. 江苏省连云港环境监测中心，江苏 连云港 222001；
2. 广东省科学院生态环境与土壤研究所，华南土壤污染控制与修复国家地方联合工程研究中心，广东省农业环境综合治理重点实验室，广东 广州 510650)
抗生素作为一种新污染物，已日益引起人们的关注，自20世纪30年代发现青霉素以来，各种抗生素被广泛应用于细菌感染类疾病的治疗。磺胺类抗生素是人工合成的一类药物, 其生产成本低, 在预防和治疗细菌感染方面具有广谱性, 因而被大量使用[1-2]。伴随着这类抗生素的广泛使用，养殖业和医疗系统产生了大量含磺胺类抗生素的废水, 这些环境中的残留抗生素会抑制有益微生物的活性，使生物产生抗药性，对生物体产生慢性毒性，随着富集作用，最终进入人体，危害人体健康。
环境中残留的抗生素大部分通过污水排放、地表径流等途径进入海洋，进而对海洋形成污染。近年来，我国近岸海域水体中检出了多种抗生素，以磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类最为常见[3-5]。目前抗生素的检测方法主要有酶联免疫法[6-7]、毛细管电泳法[8-9]、高效液相色谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[11]和气相色谱-串联质谱法[12]。根据各种方法的优缺点。液相色谱-质谱法具有灵敏度高、稳定性好、选择性强的特点。目前国内多家机构将液相色谱-串联质谱法用于水中抗生素的检测，其中也包括海水中抗生素的检测[13-16]。
海水由于基质复杂，存在较多盐类物质，在固相萃取前处理过程中会影响抗生素的富集，实验过程会存在较多干扰，前处理过程的重现性不好。现针对以上问题，采用固相萃取法，净化和富集海水中的16种磺胺类抗生素，采用加入乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)和调节pH值的方法消除基质干扰，经过HLB固相萃取柱净化富集，然后用超高压液相色谱-串联质谱仪进行测定分析。
1.1 仪器
Xevo TQD超高压液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)；
ASPE Ultra 08全自动固相萃取仪(中国睿科公司)；
S210 pH计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；
Vortex-Genie 2涡旋混合器(美国Scientific公司)；
移液器(德国艾本德公司)，注射器(美国安捷伦公司)；
SK7200H超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；
ACQUITY UPLC BEH型C18反相色谱柱(100 mm×1.7 μm，美国Waters公司)；
MCX固相萃取小柱、HLB固相萃取小柱(均为500 mg/6 mL，大连技迩科技有限公司)；
玻璃纤维滤膜(47 mm×0.45 μm，英国Whatman公司)；
针式过滤器(13 mm×0.22 μm，美国颇尔公司)。
1.2 试剂
标准品：16种磺胺类抗生素标准溶液(100 mg/L，上海安谱实验科技有限公司)，成分包括磺胺醋酰(SAA)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺二甲异恶唑(SFZ)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺多辛(SDX)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺对甲氧嘧啶(SMD)、磺胺甲氧哒嗪(SMP)、磺胺二甲嘧啶(SDM)、磺胺苯吡唑(SPA)、磺胺间二甲氧嘧啶(SDT)。内标物：磺胺间二甲氧嘧啶-D6(SDT-D6)(10 mg，上海安谱实验科技有限公司)。
其他试剂：乙腈、甲醇(色谱纯，美国赛默飞世尔公司)；
甲酸(色谱纯，成都西亚化工股份有限公司)；
乙酸铵(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；
盐酸、氨水(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；
Na2EDTA(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；
超纯水(GenPure PRO超纯水仪制备)。
1.3 仪器分析条件
1.3.1 质谱条件
离子源：电喷雾离子源，正离子模式(ESI+)扫描；
毛细管电压：3.00 kV；
脱溶剂气温度：400 ℃；
脱溶剂气流速：1 000 L/h；
锥孔气(氮气)流速：50 L/h；
扫描方式：多反应监测(MRM)扫描模式。经过优化得到16种磺胺类抗生素和内标物的质谱参数，见表1。
表1 16种磺胺类抗生素和内标物的质谱参数(1)*代表定量离子，**代表定性离子。
1.3.2 液相色谱条件
流动相：0.5%的甲酸水(A)和甲醇(B)。梯度洗脱程序：0 min，90%A；
0～1 min，90%A；
1～5 min，10%A；
5～6 min，10%A；
6～6.5 min，90%A；
6.5～8.5 min，90%A。进样量：5 μL；
柱温箱温度：25 ℃；
流速：0.3 mL/min。
1.4 标准溶液的配制
取一定量的16种磺胺类抗生素标准溶液(100 mg/L)，用甲醇配制成标准储备溶液(10 mg/L)，将标准储备溶液置于-20 ℃条件下避光保存。完全转移10 mg的SDT-D6内标物，用甲醇配制成10 mg/L的内标储备溶液，用初始比例的流动相(90%的流动相A+10%的流动相B)对标准储备液进行稀释，得到质量浓度为 0.1，1，5，10，20，50，100 μg/L的16种磺胺类抗生素溶液，每个溶液里加入50 μg/L的SDT-D6内标物。
1.5 海水样品的采集与保存
2022年4月，选择连云港3个典型入海河口，分别采集涨潮与落潮时的表层海水样品(S1—S6)，每次采集2 L海水置于棕色玻璃瓶中，4 ℃以下冷藏避光运输，48 h内在实验室完成处理。
1.6 样品前处理
水样用0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤，然后量取1 L水样，加入0.4 g Na2EDTA，用V(盐酸)∶V(水)=1∶1的盐酸溶液调节pH值至6，在全自动固相萃取仪上进行萃取、净化、浓缩。首先依次用5 mL甲醇和5 mL超纯水活化HLB小柱，然后上样，控制上样流速为5 mL/min，用10 mL超纯水淋洗，氮气以10 mL/min流速吹扫小柱10 min，用8 mL甲醇洗脱并吹至近干，用1 mL的初始比例流动相定容至1 mL，最后加入定量的内标液，过0.22 μm针式过滤器，上机待测。
2.1 质谱和液相色谱条件的优化
质谱条件优化：首先对质谱进行校准调谐，保证质谱具有良好的性能，参考调谐文件对质谱参数进行优化。实验中16种磺胺类抗生素和内标物的母离子和子离子采用Waters公司方法库里的离子对，对不同抗生素的锥孔电压和碰撞能量分别做了优化，最终得出最佳的质谱条件，实验结果见表1。
液相色谱条件优化：实验中对3种不同的流动相进行了比较，分别是5 mmol/L的乙酸铵-0.5%的甲酸水-0.1%的甲酸乙腈、0.5%的甲酸水-0.1%的甲酸乙腈和0.5%的甲酸水-甲醇。对3种流动相比例进行了目标物出峰峰形和出峰峰面积的优化，综合考虑16种磺胺类抗生素整体出峰峰形和响应值，最终选择的流动相为0.5%的甲酸水-甲醇，流速选择0.3 mL/min。16种磺胺类抗生素和内标物谱图见图1(序号对应的化合物见表1)。
图1 16种磺胺类抗生素和内标物谱图
2.2 固相萃取条件的优化
2.2.1 固相萃取柱的选择
选择HLB和MCX这2种固相萃取小柱，采用加标回收的方式，测试2种小柱的回收率。MCX小柱的前处理：先后用5 mL甲醇和5 mL超纯水活化，调节pH值至1～2，上固相萃取仪，上样完成后用5 mL甲醇淋洗，后用8 mL 5%的氨水-甲醇洗脱，氮气吹至近干，然后以初始比例的流动相定容至1 mL，加内标物，过滤膜待测。HLB小柱的前处理：先后用5 mL甲醇和5 mL超纯水活化，调节pH值至约6，上固相萃取仪，上样完成后用5 mL超纯水淋洗，后用8 mL甲醇洗脱，氮吹至近干，然后以初始比例的流动相定容至1 mL，加内标物，过滤膜待测。
16种磺胺类抗生素在HLB和MCX固相萃取柱上的回收率见图2。由图2可见，除了SMT、SDM和SMD外，其余的磺胺类抗生素在MCX固相萃取柱上的回收率都较低，而HLB固相萃取柱对16种磺胺类抗生素的回收率都比较好，回收率范围为73.3%～120.1%。分析原因，MCX固相萃取柱是离子交换柱，需要在酸性条件下与目标物进行结合，在碱性条件下释放出目标物，淋洗过程可能会导致一些目标物损失，使某些物质的回收率不理想；
而HLB固相萃取柱含有二乙烯苯和亲N-乙烯基吡咯烷酮2种基团，具有亲脂和亲水的属性，使得它对水中目标物的富集效率更有保障，而且HLB的酸碱性适用范围更广(pH值为 2～14)，所以回收率更好。因此选择HLB小柱作为固相萃取柱。
图2 16种磺胺类抗生素在HLB和MCX固相萃取柱上的回收率
2.2.2 Na2EDTA加入量的选择
海水样品中的金属离子会与抗生素产生络合反应，影响萃取效果。实验采用加入Na2EDTA的方法，络合样品中的金属离子，测试加入不同量Na2EDTA的回收率。分别在1 L海水中加入0，0.2，0.4，0.8和1.0 g的Na2EDTA，按照上述前处理方法对样品进行萃取净化，上机测试。16种磺胺类抗生素在不同Na2EDTA加入量下的回收率见图3。由图3可见，当Na2EDTA的加入量为0和0.2 g时，SAA的回收率均<50%；
当加入量为0.4～1.0 g时，Na2EDTA的加入量对16种磺胺类抗生素的回收率没有显著影响；
当加入量为0.4 g时，16种磺胺类抗生素的回收率为73.3%～125.1%。因此选择Na2EDTA加入量为0.4 g。
图3 16种磺胺类抗生素在不同Na2EDTA加入量下的回收率
采用对空白海水和空白纯水进行加标回收率比对的方式，对高盐度海水中的基质效应进行研究。在空白海水和空白纯水中分别加入16种磺胺类抗生素，使加标质量浓度为10 ng/L，调节2种加标水样的pH值为6，不加入Na2EDTA，经过HLB固相萃取柱萃取浓缩后上机待测。测定结果为，空白纯水的回收率为82.6%～117.7%，空白海水的回收率为4.9%～125.0%。实验表明，海水盐度对实验回收率影响较大，通过加入Na2EDTA可以降低这种影响，得到更加满意的实验结果。
2.2.3 水样pH值的选择
水样的pH值会影响其与固相萃取柱填料的结合效率，用V(盐酸)∶V(水)=1∶1的盐酸溶液将水样的pH值分别调节为2，4，6，8，分别加入16种磺胺类抗生素，使其加标质量浓度为10 ng/L。不同pH值条件下16种磺胺类抗生素的回收率见图4。由图4可见，当pH值=2时，SAA的回收率较低，而SMM、SMR和SCP的回收率较高；
当pH值=8时，大部分磺胺类抗生素的回收率都比较低；
当pH值=4时，SDX、SCP、SMD、SMZ、SDZ和SAA的回收率比较高；
当pH值=6时，所有抗生素的回收率范围为82.3%～123.0%。因此选择pH值=6为实验条件。
2.3 线性范围、检出限和测定下限
用初始比例的流动相配制成质量浓度为0.1，1，5，10，20，50和100 μg/L的系列标准溶液，在每个标准溶液中加入50 μg/L的SDT-D6内标物。用内标法绘制标准曲线，16种磺胺类抗生素在0.1～100 μg/L范围内线性关系良好，决定系数(R2)均>0.996。在空白水样中加入标准曲线中最低质量浓度的标准溶液，进行7次样品前处理，然后上机测试，得到该方法的检出限，16种磺胺类抗生素的检出限为0.206 5～1.023 4 ng/L，测定下限为0.826 1～14.093 5 ng/L。16种磺胺类抗生素的线性方程、决定系数、检出限和测定下限见表2。
表2 16种磺胺类抗生素的线性方程、决定系数、检出限、测定下限
2.4 准确度和精密度
在空白海水样品中分别加入高、中、低3个质量浓度(5，10，50 ng/L)的16种磺胺类抗生素标准溶液，按照上述优化好的前处理条件进行萃取，然后上机测试，做加标回收实验，实验结果见表3。由表3可见，16种磺胺类抗生素的高、中、低质量浓度的加标回收率分别为82.3%～125.7%，73.3%～125.1%，75.2%～119.2%，每个浓度的加标实验做6次，相对标准偏差(RSD)为2.4%～12.0%，该方法具有较好的准确度和精密度。
表3 16种磺胺类抗生素的加标回收率和精密度(n=6) %
2.5 实际样品测定
采集连云港市3个典型河口海域涨潮与落潮的6个海水样品，按照上述实验方法对其进行16种磺胺类抗生素的测定，实验结果见表4。
表4 连云港市典型入海河口磺胺类抗生素的分析结果
由表4可见，3个典型河口的海水中共检出3种磺胺类抗生素，分别是SDZ、SMZ和SCP， SDZ的检出值为4.3～8.2 ng/L，SMZ的检出值为45.6～63.4 ng/L，SCP的检出值为6.7～24.2 ng/L，其余磺胺类抗生素均未检出。
采用固相萃取-超高压液相色谱-串联质谱法建立了海水中16种磺胺类抗生素的分析方法。通过优化海水前处理条件和液相色谱-串联质谱仪条件，最终方法线性关系良好，检出限符合痕量分析要求。实际海水样品分析时，高、中、低加标质量浓度样品均得到较好的准确度与精密度。分析连云港市典型入海河口的海水样品，检出SDZ、SMZ和SCP 3种磺胺类抗生素，其质量浓度为4.3～63.4 ng/L。该方法应用于海水中磺胺类化合物的检测，具有快速、高效、灵敏度高的优点，对于连云港近岸海域水中抗生素的监测分析具有实际意义。
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