梁思琪，刘保山，宋 歌，郑 凯，肖 强
(1.湖北民族大学 林学园艺学院，湖北 恩施 445000；
2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)
黄精为百合科(Liliaceae)黄精属(PolygonatumMill.)植物的总称，该属植物迄今已发现60余种，我国约有31种.2020版《中国药典》收录的黄精来源于滇黄精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl)、多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua.)和黄精(PolygonatumsibiricumRed.)3个基源[1-3].湖北黄精(PolygonatumzanlanscianensePamp.)作为黄精属的一个基源，该种介于卷叶黄精和黄精之间.研究表明黄精是集药用、食品、保健于一体的高价值中草药，具有补脾、润肺生津、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤的作用[4-6].近年来各地通过野生引种驯化扩大栽培导致黄精种质混杂、种源良莠不齐，给黄精产业发展带来了严重障碍.鉴于此，许多学者对不同来源、不同种质的黄精开展了分类与鉴定研究：杨兴鑫等[7]建立的PS/AL固相萃取-LC/MS分析方法可用于快速、有效地区分3种法定基源黄精，在同基源黄精的化学成分有明显差异的情况下亦可用于区分不同基源；
王元媛等[8]通过Belousov-Zhabotinski(B-Z)振荡反应研究不同产地多花黄精的鉴别，将多花黄精粉末加入以丙二酸为耗散物的BrO3-+H++Ce4++CH2(COOH)2振荡体系，用电化学工作站记录数据，区分了不同产地的多花黄精，可用于多花黄精的鉴别分类；
李松涛等[9]通过液相色谱比较山东泰安黄精和河北黄精的指纹图谱，发现二者有显著差异，该方法可为区分其他区域的黄精提供参考.本实验通过指纹图谱[10]技术，利用傅里叶红外光谱法[11]，采用平均值法[12]建立16批不同种质黄精的指纹图谱，探寻不同种质黄精的红外光谱特征，进行相似度分析[13]，并结合聚类分析[14]与主成分分析[15]，对不同种质黄精进行区分、鉴别，为后续黄精资源的开发利用提供有效理论指导.
1.1 仪器
切片机(KD0250，广东阳江膳道机械有限公司)，流水式高速中药粉碎机(LG-20，瑞安市百信制药机械有限公司)，电热恒温鼓风干燥机(DHG-9203A，上海善志仪器设备有限公司)，玻璃干燥器(1351-450，广州诚仪诺仪器)，傅里叶红外光谱仪(Nicolet iS50 FT-IR，分辨率：中远红外波段小于0.09 cm-1，近红外波段小于2 nm，光谱范围：27 000～15 cm-1，Thermo公司).
1.2 材料
采自不同产区的黄精样品，均同园栽培24个月.由湖北省农科院中药材研究所廖朝林研究员鉴定为黄精(P.sibiricum)(S1～S3)、多花黄精(P.cyrtonema)(S4～S8)、滇黄精(P.kingianum)(S9～S11)、湖北黄精(PolygonatumzanlanscianensePamp.)(S12～S16).
表1 样品信息Tab.1 Sample information
2.1 样品制备
将采摘的不同基源黄精的新鲜根茎除杂、清洗、烘干、粉碎后过40目筛，放入干燥器内，实验室湿度保持30%，二氧化碳浓度正常.
2.2 红外光谱采集及数据预处理
以KBr为背景累积扫描32次，每个样品重复测定5次，每次间隔1 h，累计获得5个光谱图，对数据进行校正，除去基线影响，然后进行标准归一化处理，去除不同样本间称量的差异.利用SPSS 23.0进行聚类分析和主成分分析.
2.3 方法学考查
精密度：对同一样品进行多次扫描，比较所得图谱的差异，检测仪器精密度.取S1样品进行测定，重复测定5次，所得红外图谱的相似系数在0.999 9～1.000 0，RSD为0.003 7%，表明精密度良好.
稳定性：对同一样品不同时间段进行多次扫描，比较所得图谱的差异，确定样品本身稳定性.取S1样品每隔1 h进行测定，连续测定5次，所得红外图谱的相似系数在0.999 9～1.000 0，RSD为0.003 7%，表明稳定性良好.
重现性：对同一样品制备多份进行扫描，比较所得图谱的差异，确定样品本身重现性.取S1样品，按“2.1”条件制备5份，分别进行测定，所得红外图谱的相似系数在0.984 5～0.999 4，RSD为0.56%，表明重复性良好.
2.4 黄精指纹图谱的建立
测定所有黄精样品的红外图谱，将处理后数据导入SPSS 23.0软件进行系统聚类；
再将数据导入SIMCA 14.1进行主成分分析，进而对黄精进行种质鉴别.
图1 16批黄精样品红外图谱Fig.1 Infrared spectrum of sixteen batches of Polygonatum sibiricum samples
图2 黄精红外共有模式指纹图谱Fig.2 Infrared common mode fingerprint of Polygonatum sibiricum
图3 不同种质黄精相关系数Fig.3 Correlation coefficient of Polygonatum sibiricum from different germplasm
3.1 不同种质黄精红外光谱分析
取16批黄精样品，按“2.2”条件制样，测定其红外光谱图，保存为CSV文件后，将数据输入Origin 8.0，绘制波数为横坐标，透过率为纵坐标的红外图谱，如图1所示.从图1中可以看出，16批黄精药材的红外图谱峰形、峰位大致相同，在吸收峰的强弱方面存在一定差异，这表明16批黄精药材的主要成分相似.
采用平均值法获得16批药材的共有模式，如图2所示.由图2可知3 373.53、2 913.26、1 735.34、1 638.32、1 420.54、1 130.43、1 126.03、930.37 cm-1为黄精药材的主要特征峰.在3 373 cm-1处的吸收谱带宽而强，为O-H伸缩振动和N-H伸缩振动叠加，主要贡献物为蛋白质和核酸[16]；
2 913 cm-1附近为饱和C-H伸缩振动，主要贡献物为脂肪酸化合物；
1 735 cm-1附近为C=O伸缩振动，主要贡献物为脂类物质；
1 200～900 cm-1范围为多糖吸收区[17]；
890～840 cm-1处为吡喃环的β异构体[18]；
540 cm-1附近为其他糖残基[18].由此可知，黄精红外光谱主要由蛋白质、脂类和糖类等吸收带组成.
3.2 相似度分析
利用测定并经过处理后的16批黄精红外数据，通过红外光谱数据与共有模式光谱数据进行皮尔逊相似度计算，结果如图3所示.
由图3可以看出，用相似系数法计算16批不同种质黄精的红外图谱与共有模式图谱的相似度基本在0.900 0以上，最低值是云南文山滇黄精，相似度是0.900 2，但仍具有较高的相似性，表明不同种质黄精的一致性较好，主要成分相似；
其中黄精相似系数介于0.971 6～0.989 4，多花黄精相似系数介于0.979 7～0.994 0，滇黄精相似系数介于0.900 2～0.990 0，湖北黄精相似系数介于0.947 6～0.978 4.实验结果表明，同种黄精样本间具有较好的相似性，差异较小.
3.3 聚类分析
使用软件SPSS 23.0 将黄精属16批不同种质黄精的红外指纹图谱做系统聚类分析，聚类方法选择瓦尔德法，区间选择欧式距离，得到黄精树状图如图4所示.
由图4可知，当欧氏距离为5时，多花黄精、黄精、滇黄精和湖北黄精各聚为1类；
表明通过傅里叶红外光谱法可以快速鉴定不同基源黄精.当欧氏距离为15时，所有黄精样品聚为2大类，多花黄精单独聚为1类，黄精、滇黄精和湖北黄精聚为1类；
说明湖北黄精与黄精、滇黄精内部质量差异较小，且与多花黄精存在一定差异.
图4 16批黄精样品聚类分析Fig.4 Cluster analysis of sixteen batches of Polygonatum sibiricum samples
图5 主成分法分析主成分累计贡献率Fig.5 Cumulative contribution rate of principal components analyzed by principal component method
图6 不同种质黄精的主成分得分散点图Fig.6 Principal component scores of Polygonatum sibiricum from different germplasm
3.4 主成分分析
主成分分析即利用降维思想，在尽可能多地保留原始变量信息的情况下，通过少数几个主成分揭示多个变量间的关系.向SIMCA-14.1 中导入16批黄精样品红外光谱数据，进行因子分析.主成分法分析主成分累计贡献率如图5所示.其中PC1、PC2(PC1表示能描述多维数据矩阵最明显的特征，PC2表示除PC1之外能描述多维数据矩阵最明显的特征)累计贡献率达到了81.6%，表明该2个主要成分包含了原始变量中81.6%以上的信息，即包括了图谱中的绝大多数信息.Q2>0.5表明构建的模型预测能力良好.根据PC1、PC2绘制主成分得分散点图如图6所示.由图6可知，在主成分得分图上所有黄精样品被聚为4类，多花黄精、黄精、滇黄精和湖北黄精各聚为1类，与聚类分析结果一致.其中黄精、滇黄精和湖北黄精大都聚在PC1得分图的负值区域，说明湖北黄精与黄精、滇黄精的亲缘关系较近；
多花黄精位于PC1得分图的正值区域，说明湖北黄精与多花黄精存在一定差异.因此，采用主成分分析方法能有效应用于不同种质黄精植物的生物学鉴定与质量评价.
利用傅里叶变换红外光谱技术对16批不同种质黄精进行红外光谱指纹图谱分析，16批黄精样品的指纹图谱大致相似，表明不同种质黄精均一性较好，亲缘关系较为接近.红外光谱指纹图谱显示，黄精块茎主要成分为糖类、脂类和蛋白质等.进一步对16批黄精样品进行相似度分析，通过计算皮尔逊相关系数可知，同种黄精组内样本间具有较好的相似性，差异较小.通过聚类分析与主成分分析均可将多花黄精、黄精、滇黄精与湖北黄精4种不同种质的黄精区别开来，说明此法能有效地应用于黄精属植物的分类与鉴定；
通过聚类分析图与主成分分析图还可以得到湖北黄精与黄精、滇黄精的聚类较近，亲缘关系近些；
湖北黄精与多花黄精聚类较远，存在一定差异，说明此法能有效应用于不同种质黄精的质量评价.采用傅里叶红外光谱分析既可以减少对黄精根茎部分的浪费，最大程度保留药材的原始信息，又可以快速鉴定不同基源的黄精.该法精密度、稳定性、重复性较好，可用于对不同种质黄精药材质量的综合评定，并为其他种质黄精的鉴定提供参考.本文只针对湖北黄精同3种基源黄精的种质鉴定进行了研究，有关黄精属资源的成分测定及其活性比较有待于后续研究.