赵 贺 王诗琦 陈俊山 赵世文
(辽宁省蚕业科学研究所，辽宁凤城 118100)
柞蚕微粒子病俗称锈病、渣子病、底子病，是有柞蚕微孢子虫寄生引起的慢性传染病。此种柞蚕病害历史悠久，清朝时期就有较多文献记载过，如今世界各柞蚕产区该病也均有发生，材料茧生产一般年份发病率为30%～70%，严重年份可达90%以上，造成柞蚕减产30%左右[1]。为减少该病的发生与危害，柞蚕技术人员选择显微镜镜检的方式，查明母蛾是否带有微粒子原虫，这是预防胚胎传染微粒子病的最有效方法，也是提高种茧质量，确保柞蚕产量的一项必要措施。按目前柞蚕生产制种情况，柞蚕镜检分为两种，一是柞蚕育种制种镜检，二是柞蚕生产制种镜检。柞蚕生产制种镜检是柞蚕生产制种过程中的重要环节，柞蚕生产制种是为柞蚕生产材料茧提供种卵，提供的种卵为杂交种，经过1代春季放养后即进入生产材料茧阶段，制种要求标准虽低于柞蚕育种制种，但严格保证柞蚕生产制种镜检质量对秋蚕生产产量及质量仍至关重要。本文对柞蚕生产制种镜检的技术进行总结，以期为柞蚕生产制种镜检提供参考。
1)镜检场所准备：按用途可分为制片区、显微镜检查区、洗涤区。制片区内需要有掏蛾、穿刺、点片的工作台，装废蛾的器具；
显微镜检查区要清洁、明亮，光线充足，工作台要整洁；
洗涤区要有上下水，室外要有宽敞的环境晾晒点片玻璃条。
2)镜检用具：载玻片(25mm×5mm×3mm白玻璃条)、盖玻片、滴水瓶、载玻片垫板、600～720倍电子生物显微镜、火柴棍、擦镜纸等。
目前柞蚕生产制种的整个镜检过程由制片组、镜检组、洗涤组、扒卵组、清理组、称量组、保卵组组成，每项工作都保质保量完成才能保证整个镜检过程有序高效进行。
制片组：此环节每小组一般2～3人。以3人一组为例，1人负责将产卵袋内母蛾掏出，并将产卵袋按次序排好，1人接过母蛾后用火柴棍在母蛾腹部背处2～3环节皮下脂肪处插入，旋转几下后拔出，将带有脂肪组织的火柴棍交于点片人研磨。点片人将长条载玻片放在垫板上，每个垫板上要有10个点片位置标记，点片人用滴水瓶按10个点片标记滴上10滴适宜量的清水。长条载玻片一端斜口、一端齐口，以斜口端为开始端，即第一个点对应第一个产卵袋内母蛾。点片人将带有脂肪组织的火柴棍按照次序在相应水滴处进行3～5圈的研磨，每个产卵袋对应一个点片位置，研磨完成后，丢弃火柴棍，迅速盖好盖玻片，继续进行下一个点片工作。整条载玻片10个点片程序都完成后，掏蛾人将排好次序的产卵袋递给点片人，点片人将载玻片放在产卵袋上放置于显微镜旁，以备镜检人员检查使用。制片组重点工作是产卵袋的排序，排列次序一定要准确无误，在完成一组点片程序后，将产卵袋递于点片人的过程中，切记不能把产卵袋翻转，否则产卵袋的次序就会整个打乱，造成镜检人将无毒蚕卵舍弃而将有毒蚕卵留下；
点片人点片时，一定要以斜口端为起始端，每条载玻片点10个点，即对应10个产卵袋的母蛾，禁止少点和多点，保持每条载玻片点10个点的规则不变，这样可以有效减少点片过程中出现的失误。
镜检组：正式镜检前，镜检人员要先检查显微镜视野是否清楚，调整显微镜灯光亮度和光圈大小，调整到一个适宜的亮度和进光量，保证视野清晰。点片人员将点好的载玻片和产卵袋放置在显微镜旁后，镜检人员拿起载玻片，以斜口端为镜检起始端，调整粗螺旋及细螺旋，将视野调整到一个清楚看到蛾脂肪组织的位置，此时轻轻推动载玻片，微微调整细螺旋，一个点查看了5个清晰视野后，再进入下一个点的检查。镜检过程中，发现有微粒子孢子的点，将此处盖玻片向上推出，然后进入下一个点的检查，整条载玻片10个点全部检查完成后，确认有微粒子点盖玻片的位置点，然后将对应的产卵袋舍弃，此工作一定要做到准确无误。目前镜检用的显微镜大部分都是单筒显微镜，镜检人员在镜检时，要保持双眼睁开的状态，严禁闭一只眼进行镜检工作，这样会造成眼部疲劳、失误增多。提倡镜检培训时，用左手向右推动载玻片，用右眼看目镜，左眼看载玻片，这样在完成一个点进入下一个点的过程中，右眼不用离开目镜，有利于加快镜检速度。镜检中，目镜观察到的清晰视野有两个，即分上下两层，由于微粒子孢子比重大多沉于下层，所以镜检的目标视野是下层[2]。镜检过程中会发现，点片人滴水多少直接影响镜检质量。滴水过多，盖玻片的外缘会有多余的水，在盖玻片推动过程中，多余水容易污染镜头，污染镜头后，需要先完成镜头清理，然后才能正常镜检；
滴水过少，会使盖玻片和载玻片紧紧贴合在一起，视野清晰度较差，增大漏检的几率，所以镜检人员在镜检初始期要根据视野情况及时告知点片人是否需要调整点片时的滴水量，这样经过2～3条点片过程，点片人即可较好地控制点片滴水量。镜检过程中，遇到无法看到清晰视野的情况时，首先选择退回看上一个点，如果上个点可以清晰看出，此时再看下一个点，一般就能解决问题；
如退回下个点仍然无法看清，此时考虑镜头污染的问题，看上个点和待检点中间及周围是否有多余的水或者母蛾脂肪组织，如是多余水造成镜头污染，可用擦镜纸擦拭镜头并清除污染水，如是脂肪组织造成镜头污染，此时可以在载玻片的两端空隙较大的地方滴两滴清水，调整粗螺旋，让镜头多次和清水接触和分离，然后用擦镜纸迅速吸走镜头多余水分，即可解决脂肪组织污染镜头问题。镜检人员在拿到载玻片镜检前，可以先观察盖玻片周围是否有多余的水或脂肪组织，发现多余水或脂肪组织后，用面巾纸擦拭多余水或脂肪组织后再进行镜检，这样就可以减少污染镜头的情况出现。镜检人员在镜检推片过程中，如左眼看到盖玻片周围有多余水或脂肪组织时，推片过程可以绕过该处，防止污染镜头。镜检工作在整个制种过程中至关重要，所以镜检人员一定要经过长期培训，严格考试，取得上岗合格证后才能持证上岗。镜检人员在镜检过程中，如遇到无法解决的镜检问题时，应立即告诉点片人停止点片，然后告知镜检室负责人相关情况，及时解决问题，切禁带问题进行镜检作业。
洗涤组：洗涤组人员工作是将载玻片及盖玻片收集、洗涤、晾晒。洗涤人要及时收集镜检后的载玻片，收集后将盖玻片推到水中小塑料筐内，将推完盖玻片的载玻片放在有水的大盆中。盖玻片收集一定量后，将装有盖玻片的小塑料筐在洗衣粉或洗涤剂溶液中轻轻晃动，洗去脂肪组织等，然后在清水的塑料盆内继续清洗，清洗2～3遍至无污染物即可，置于水盆上方控去多余水分。将盖玻片放入一个陶瓷盘中，将陶瓷盘放入微波炉，用中小火烘烤10～15 min。微波炉烘烤禁止使用大火，大火可以缩短盖玻片干燥时间，但极易造成盖玻片破碎，减少盖玻片的使用次数。长条载玻片用清水清洗干净后，放置在室外进行晾晒，晾干后及时收取以备镜检使用。扒卵组：镜检人员将无毒产卵袋放于身后待扒卵盆中，扒卵人员进行扒卵。扒卵人员拿起5～6个产卵袋，袋口朝下，双手搓动产卵袋，让卵落入盆中，然后再单个产卵袋检查，手伸进产卵袋中，将粘附在产卵袋上的卵粒扒入盆中。空产卵袋袋口朝上，压紧放入空筐内，以备下次产卵使用。扒卵过程中，一定要检查仔细，防止卵遗漏在产卵袋中。完成一个品种扒卵后，要及时将扒好的卵收集到一个盆中，做好标记后放置一旁，待进入下一个卵清理程序。
清理组：扒好的卵集中后，进入清理环节。此时卵内有蛾膀、蛾爪、蛾灰、皮套、火柴棍、盖玻片等，首先清理大的表层垃圾，如火柴棍、皮套、大的蛾膀等。目前卵清理有两种方式，一是人工用簸箕清理多余的卵内垃圾，二是用蛾籽电动清理机。人工清理时，要在地上铺上纱网，把卵内垃圾用簸箕清理到纱网上，把清理后的卵倒入盆中；
完成一个品种后，要把纱网上的垃圾倒入簸箕中再次进行清理，将遗落的卵清理出来。蛾籽电动清理机清理时，先将盆中大卵粒带手套搓成单个卵粒或小卵粒，再将卵倒入机器入口容器内，开动机器，调成一个适宜的进风量和筛动量，下面两个出口处放置两个接置桶。一般一个循环很难将卵内垃圾清理干净，所以电动清理卵时，最少要完成2个循环才能将卵内垃圾清理干净。一个品种卵完成清理后，要关闭电源，打开电动清理机，将清理机内遗落的卵清理出来，以待清理下个品种使用。清理组工作如果是人工清理时，对清理人使用簸箕技术要求较高，所以要选用技术较好的人作为人工清理人员。电动清理时，要清理人熟练掌握清理机的使用方法，调整好适宜的进风量、筛动量和进卵量，才能较好较快的完成卵清理工作。
称量组：整个镜检工作完成后，镜检出来的卵要进行分袋称重，每袋1～1.5 kg，计算出各品种卵总量，继而计算出百蛾产卵量、微粒子卵比例等。在进行称量前，首先要把同品种卵混合均匀，然后再进行称量。
保卵组：由于柞蚕卵未完成整个受精过程，所以卵称量后需要进入高温保卵室，温度18～20 ℃、相对湿度75%保存24 h，以完成整个受精过程。每日进保卵室时间和出保卵室时间都要固定，以保证整个制种期种卵积温大致相同。待完成24 h保卵后，卵再进入温度5～8 ℃的低温保卵室进行保存。保卵时，将装卵袋平铺在茧床上，要求茧床高度相同，保证卵积温大致相同。
柞蚕生产制种镜检是保证柞蚕生产质量的重要环节，肉眼选蛾阶段仅能淘汰弱蛾，病症不明显的微粒子病蛾只能依靠镜检才能查出患病个体，进而杜绝微粒子病的母体传染。柞蚕生产制种的制种量较大，镜检工作繁重，如何高质量完成镜检工作，熟练掌握各项工作的操作规程尤为关键。所以在制种过程中要尽量保证镜检工作人员稳定，切忌临时调换镜检人员，任何一个环节人员操作不当，都可能造成整个镜检工作前功尽弃。
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