寇 蓉，冯国杨，李 晨，范晓军
（1.太原理工大学生物医学工程学院，山西 晋中 030600；
2.山西杏花村汾酒集团有限责任公司，山西 汾阳 032205；
3.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；
4.太原理工大学 环境科学与工程学院，山西 晋中 030600）
传统山西陈醋酿造过程是在开放的环境中进行[1-2]，尽管原料高粱需要进行蒸煮处理，但在操作过程中极易从操作工具、车间空气、车间地面等环境中引入微生物，这些微生物在富含营养的醋醅基质中生长代谢和繁衍，在一定程度上影响着食醋风味和酿造的稳定性[3]。先前的研究主要对食醋酿造发酵剂进行了大量研究[4-6]，而在生产实践中不同车间酿造的食醋品质往往存在差异，这表明车间环境中的微生物可能会参与到食醋的酿造过程中，进而影响食醋的品质。此外，火醅作为醋酸发酵的引子[7]，其对食醋酿造微生物的影响仍缺乏针对性研究。山西陈醋酿造过程中在醋酸发酵阶段加入生料麸皮，既增加了醋醅的疏松度，促进氧气的传递[8]，也为醋酸发酵提供了重要的营养物质。生料麸皮的添加是否同时会向酿造系统中引入某些微生物，这一问题值得深入探讨。
微生物溯源方法的建立使复杂微生物系统的菌群来源分析成为可能，也促进了研究者对食品酿造过程中微生物来源的解析。如WANG等[9]采用SourceTracker确定了大曲和环境微生物对我国谷物发酵白酒中微生物群落的贡献，其中，发酵过程中的好氧菌和兼性厌氧菌主要来源于大曲，而厌氧菌主要来源于窖泥。2019年提出的快速期望最大化微生物源跟踪（FEAST）方法比SourceTracker方法具有更高的精度和更快的速度[10]，该方法已经广泛地应用于土壤[11]、医学[12-15]、污泥[16]等领域微生物的溯源分析。
本研究以山西陈醋酿造发酵剂、车间环境微生物、辅料麸皮和发酵醅为研究对象，利用高通量测序技术研究微生物群落的结构和多样性，并采用FEAST方法解析了发酵剂、车间环境、操作工具、末期酒醅、辅料麸皮和火醅中的微生物对食醋酿造过程微生物组成的贡献，对深入认识食醋酿造过程和发酵过程控制都具有重要意义。
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料发酵剂、车间环境和操作工具微生物样品、辅料麸皮和发酵醅样品均取自山西清徐县某醋厂。大曲（Daqu）、快曲（Kuaiqu）和麸皮（Bran）分别取自曲房和辅料室，Quick Take 30空气微生物采样器放置于发酵车间内工作7 d，用于采集车间空气中的微生物（Air）。工具表面（Tools）（如铁锨、笤帚等）、车间地面（InG）和室外地面（OutG）的微生物采用浸有0.1 mol/L PBS缓冲液的无菌棉擦拭获取[17]。发酵醅样品取同一批次淀粉糖化（starch saccharification，Sac）发酵第2天样品（编号Sac2）、酒精发酵（alcohol fermentation，AF）第12天样品（编号AF12）、醋酸发酵（acetic acid fermentation，AAF）第1天样品（编号AAF1）和前批次醋酸发酵第3天样品（编号AAF3）。糖化和酒精发酵阶段样品取自发酵池的顶部、中部和底部，混合后得到测试样；
醋酸发酵阶段样品在距离发酵池表面30 cm的深度进行东西南北中五点采集，混合均匀后作为醋酸发酵阶段的测试样。样品用无菌密封袋封装，-20℃保存备用。
1.1.2 试剂酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；
脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物、50×TAE缓冲液、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）裂 解液、溶菌酶：上海生工生物工程股份有限公司；
DNA聚合酶、缓冲液：美国NEB公司；
GeneJET胶回收试剂盒：美国Thermo Fisher Scientific公司；
TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒：美国Illumina公司。
1.2 仪器与设备
DZKW-D-2电热恒温水浴锅：北京市水光明医疗仪器有限公司；
Neofuge 15R高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；
DYY-6C电泳仪：北京市六一仪器厂；
NanoVue plus超微量紫外分光光度 计：英 国Cytiva公 司；
T100梯 度PCR仪：美 国Bio-Rad公司；
Novaseq6000高通量测序平台：美国Illumina公司；
Quick Take 30空气微生物采样器：美国SKC公司。
1.3 方法
1.3.1 基因组提取与检测采用CTAB法[18]对醋醅样本的微生物宏基因组进行提取，操作如下：（1）吸取1 000 μL CTAB裂解液至2.0 mL EP管里，加入20 μL溶菌酶，将适量的样品加入裂解液中，65℃水浴（时间为2～3 h），期间颠倒混匀数次，以使样品充分裂解。（2）离心取950 μL上清，加入与上清等体积的酚（pH值8.0）∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1，V/V），颠倒混匀，12 000 r/min离心10 min。（3）取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1，V/V），颠倒混匀，12 000 r/min离心10 min。（4）吸取上清至1.5 mL离心管里，加入上清液3/4体积的异丙醇，上下摇晃，-20℃沉淀。（5）12 000 r/min离心10 min，倒出液体。用1 mL体积分数为75%乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出。（6）超净工作台吹干或者室温晾干。（7）加入51 μL ddH2O溶解DNA样品。（8）加RNase A 1 μL消化核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），37℃放置15 min。之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性并用超微量分光光度计测定DNA的浓度与纯度。
1.3.2 PCR扩增与高通量测序用引物515F（5"-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3"）、806R（5"-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3"）和 引 物ITS3-2024F（5"-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3"）、ITS4-2409R（5"-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3"）分 别 扩 增 细 菌16S rRNA基 因V4区 和 真 菌ITS2区。PCR扩 增 体 系：Phusion Master Mix（2×）15 μL，引物各1.5 μL，基因组DNA（genomic DNA,gDNA）10 μL，H2O 2 μL。PCR扩增条件：98℃预变性1 min；
98℃变性10 s，50℃退火30 s；
72℃延伸30 s，共30个循环；
72℃再延伸5 min。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，高通量测序委托北京诺禾致源科技股份有限公司。
1.3.3 高通量测序数据分析测序原始序列通过序列拼接、过滤、质量控制、去除嵌合体，最终获得有效序列[19-22]。利用Uparse算法（Uparse v7.0.1001）以97%的一致性将所有样本的有效序列聚类成为操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）[23]。使用Mothur软件与SILVA（v138.1）数据库对细菌OTUs序列进行物种注释分析，应用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）与Unite（v8.2）数据库对真菌OTUs序列进行物种注释分析，并分别在门、纲、目、科、属水平上统计各样本的群落组成。对以上各样本数据进行均一化处理，用于后续Alpha多样性分析。
1.3.4 FEAST溯源分析FEAST溯源分析通过网站（https://github.com/cozygene/FEAST）提供的R语言在RStudio程序中运行完成。传统工艺山西陈醋是通过高温蒸料糊化后加入发酵剂进行糖化和酒精发酵，酒精发酵结束后将酒醅与辅料麸皮混合，并将前批次醋酸发酵第3天的醋醅（俗称火醅）作为种子发酵剂引入到新批次的醋酸发酵阶段。因此，本研究也将火醅微生物纳入到醋酸发酵第1天的微生物来源分析当中。此外，酿造车间环境中的微生物经过长时间的积淀，其菌群组成对食醋发酵过程也有着重要的影响。本研究针对山西陈醋酿造微生物的溯源分析分2个部分，其一以发酵剂（大曲和快曲）和车间环境微生物（车间空气、车间地面、工具表面、室外地面）种群为源端，糖化发酵第2天微生物种群为接受端进行溯源分析；
其二以酒精发酵第12天的酒醅、辅料麸皮、车间环境微生物（车间空气、车间地面、工具表面、室外地面）和火醅种群为源端，醋酸发酵第1天微生物种群为接受端进行溯源分析。
1.4 数据分析
使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Observed-OTUs、Shannon、Chao1及Coverage指 数。利 用Origin 8.5软件绘制稀释曲线和门水平、属水平物种相对丰度柱状图。
2.1 样品测序数据分析
基于高通量测序技术对发酵剂、车间环境微生物样品、辅料麸皮和发酵醅样品中细菌和真菌的有效序列和OTUs进行研究，结果如表1所示。
表1 样品中细菌和真菌的序列信息Tab.1 Sequence information of bacteria and fungi in samples
11个样品共产生706 931条细菌有效序列、673 733条真菌有效序列。将有效序列以97%的一致性聚类成为OTUs，结果发现，空气中细菌OTU最多，有1 487个；
麸皮中真菌OTU最多，有462个；
糖化发酵第2天样品中细菌OTU最少，有464个；
大曲中真菌OTU最少，有60个。所有样品中细菌OTUs均大于真菌OTUs，说明发酵剂、车间环境微生物样品、辅料麸皮和发酵醅样品中细菌群落多样性远高于真菌群落，大曲中的微生物种类更为鲜明和集中。
2.2 醋醅样品Alpha多样性分析
稀释曲线直接反映测序数据量的合理性，山西陈醋酿造发酵剂、车间环境微生物、辅料麸皮以及发酵醅的微生物测序稀释曲线如图1所示。山西陈醋酿造发酵剂、车间环境微生物、辅料麸皮以及发酵醅样品中微生物的Alpha多样性指数结果如表2所示。
表2 样品中细菌和真菌群落Alpha多样性指数Tab.2 Alpha diversity indexes of bacterial and fungal community in samples
图1 样品中细菌（a）和真菌（b）的稀释曲线Fig.1 Dilution curves of bacteria（a）and fungi（b）in samples
由图1可知，所有样品的稀释曲线渐近平坦并且Coverage指数均＞0.99，表明测序可以反映各样本中绝大多数微生物群落特征和多样性信息。
Shannon指数和Chao1指数分别为多样性指数和丰富度指数。其中，Shannon指数用于表征微生物群落内物种分布的多样性和均匀度。微生物群落多样性越高，物种分布越均匀，Shannon指数越大。Chao1指数用于估计微生物群落中包含的物种总数，微生物群落丰富度越高，Chao1指数越大。由表2可知，所有样本细菌群落的多样性和丰富度均大于真菌群落。在泸州酒中温大曲和山西老陈醋大曲中也检测到细菌群落的丰富度和多样性高于真菌群落[24-25]。空气中细菌群落的多样性和丰富度最高，真菌群落的丰富度最高，在清香类型白酒发酵车间微生物的研究中也检测到空气中细菌群落的多样性高于其他环境样品[17]。这些空气中丰富的微生物为食醋酿造提供了充足的微生物资源，也是地域生态特征的重要体现。此外，麸皮中真菌群落的多样性最高；
大曲中真菌群落的多样性和丰富度最低；
快曲中细菌群落的多样性最低；
Sac2中真菌群落的丰富度最低。
2.3 微生物群落结构分析
基于门水平发酵剂、车间环境微生物、辅料麸皮以及发酵醅中的细菌和真菌群落结构分析，结果如如图2所示。由图2可知，大曲和麸皮中变形菌门（Proteobacteria）是优势细菌门，其余样本中硬壁菌门（Firmicutes）是优势细菌门。王佳丽[25]对山西老陈醋大曲的研究结果显示，硬壁菌门（Firmicutes）是主要的细菌门；
王雪山[17]对清香类型白酒使用的中温大曲研究发现，成品曲硬壁菌门（Firmicutes）占主导，新曲中变形菌门（Proteobacteria）占主导地位，这些研究结果产生差异的原因可能是取样季节、大曲储存时间以及大曲发酵过程中水活度、酸度、温度等发酵微环境因素对微生物的自然筛选作用导致的[26]。麸皮中担子菌门（Basidiomycota）是优势真菌门，其余样本中子囊菌门（Ascomycota）是优势真菌门。
图2 基于门水平各样品中细菌（a）和真菌（b）群落结构分析Fig.2 Community structure analysis of bacterial（a）and fungal（b）in samples based on phylum level
基于属水平山西陈醋酿造发酵剂、车间环境微生物、辅料麸皮以及发酵醅样本中的细菌和真菌群落结构分析，结果如图3所示。由图3可知，车间环境（工具表面、车间地面、车间空气和室外地面）、醋酸发酵第1天样品和火醅样本中乳酸杆菌属（Lactobacillus）和醋酸杆菌属（Acetobacter）是主要的细菌属。糖化发酵第2天样品和酒精发酵第12天样品中主要的细菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）和Limosilactobacillus。大曲中优势细菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus），其相对丰度仅为3.68%。快曲中优势细菌属为魏斯氏菌属（Weissella），相对丰度达69.59%。不动杆菌属（Acinetobacter）和金黄杆菌属（Chryseobacterium）是麸皮中主要的细 菌属。
图3 基于属水平各样品中细菌（a）和真菌（b）群落结构分析Fig.3 Community structure analysis of bacterial（a）and fungal（b）in samples based on genus level
大曲中复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）占绝对优势，其相对丰度达99.06%，这与Alpha多样性指数的结果一致。快曲中曲霉属（Aspergillus）和根霉属（Rhizopus）是主要的真菌属。糖化发酵第2天样品、酒精发酵第12天样品和火醅样品中复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）和酵母菌属（Saccharomyces）是主要的真菌属；
醋酸发酵第1天样品中主要的真菌属为复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）和布氏白粉菌属（Blumeria）。节担菌属（Wallemia）和丝孢菌属（Trichosporon）是麸皮样品中主要的真菌属；
布氏白粉菌属（Blumeria）和酵母菌属（Saccharomyces）是工具表面样品中主要的真菌属；
毕赤酵母属（Pichia）和复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）是室外地面样品中主要的真菌属；
复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）和Cercospora是室内地面样品中主要的真菌属；
酵母菌属（Saccharomyces）和复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）是空气样品中主要的真菌属。
2.4 食醋酿造微生物溯源分析
糖化发酵第2天样品和醋酸发酵第1天样品中细菌和真菌群落的溯源分析如图4所示。从图4可以看出，在糖化发酵第2天样本中细菌群落中有6.18%来自车间地面，3.66%来自工具表面，1.17%来自车间空气；
真菌群落中有86.66%来自大曲。醋酸发酵第1天样本中细菌群落有13.94%来自工具表面，9.43%来自火醅，8.91%来自酒精发酵第12天的酒醅；
真菌群落中有52.39%来自工具表面，31.40%来自车间空气，8.46%来自酒精发酵第12天的酒醅。
图4 糖化发酵第2天样品（a）和醋酸发酵第1天样品（b）中微生物溯源分析Fig.4 Microbial source tracking of samples on the second day of saccharification fermentation（a）and the first day of acetic acid fermentation（b）
传统山西陈醋采用循环接种工艺，即在醋酸发酵阶段开始，将火醅作为醋酸发酵第1天的种子发酵剂，本研究结果也显示，在醋酸发酵第1天，有9.43%的细菌群落和4.02%的真菌群落来源于火醅，在保宁醋发酵过程中也表明回糟的引入极大地丰富了发酵初期醋醅中微生物的种类[27]。
尽管Alpha多样性指数显示，大曲中真菌群落的多样性和丰富度最低，但是大曲对糖化发酵第2天样品中真菌群落的贡献达86.66%，这表明大曲中含量突出的菌种在食醋酿造中发挥了巨大的潜能。
本研究基于高通量测序技术和FEAST方法研究了山西陈醋酿造发酵剂、车间环境微生物、辅料麸皮以及发酵醅微生物的群落组成结构和多样性以及酿造微生物的来源。结果表明，所有样本中细菌群落的多样性和丰富度大于真菌群落。大曲中优势细菌属和真菌属分别为乳酸杆菌属（Lactobacillus）和复膜孢酵母属（Saccharomycopsis），而快曲中优势细菌属和真菌属分别为魏斯氏菌属（Weissella）和曲霉属（Aspergillus）。车间环境（工具表面、车间地面、室外地面和车间空气）、醋酸发酵第1天样品和火醅样本中乳酸杆菌属（Lactobacillus）和醋酸杆菌属（Acetobacter）是主要的细菌属。FEAST结果显示，糖化发酵第2天样本中细菌群落主要来自车间地面和工具表面；
真菌群落主要来自大曲。王雪山[17]在对新厂区和老厂区清香类型白酒发酵微生物溯源分析发现，大曲对老厂区和新厂区发酵0 d酒醅中真菌群落的贡献大于细菌群落。这表明酿造微生态对外加微生物具有选择性，真菌群落更易在糖化发酵第2天的发酵稀醪中生存，这可能与其相对致密的细胞壁结构有关。醋酸发酵第1天样本中细菌群落主要来自工具表面、火醅和酒精发酵第12天的酒醅；
真菌群落主要来自工具表面、车间空气和酒精发酵第12天的酒醅。本研究首次对山西陈醋发酵微生物的来源进行了系统解析，获得了山西陈醋酿造生态中主要的微生物源端对陈醋发酵微生物群落的贡献，为山西陈醋酿造过程调控提供了科学的理论依据。
本研究仅讨论了单个季节环境微生态数据以及山西陈醋发酵微生物的来源，而环境微生态易受季节变化的影响，进而影响食醋酿造过程。因此，以后应开展不同季节环境微生态对食醋发酵过程的影响方面的研究。
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