李纪潮，张金渝，蔡明姬，陈秀花，唐乙云，杨绍兵*
（1云南省农业科学院药用植物研究所，云南昆明 650231；
2云南省元谋县黄瓜园镇农业农村服务中心，云南楚雄 652100；
3云南省贡山县农业农村局，云南怒江傈僳族自治州 673200；
4云南省怒江州木本油料产业发展研究所，云南怒江傈僳族自治州 673200）
【研究意义】草果（Amomum tsao-ko）为姜科豆蔻属多年生常绿丛生草本植物，在我国具有悠久的食、药用历史，既是食品调料中的“五香之一”，同时具有燥湿除寒、祛痰截疟等药用功能（Liu et al.，2019）。云南省是我国草果主产区，种植面积占全国95%以上，怒江州作为草果的最适宜生长区，同时地处中缅国界线的地理位置，草果的广泛栽培和产业发展已作为政府实施“一带一路”的重要经济部署，全州带动种植草果6.93×104ha，已成为乡村振兴的“致富果”（杨绍兵和张金渝，2018）。云南省农业科学院专家团队2014—2018年对怒江州草果病虫害的调查结果表明，叶斑病类病害对草果产量和品质的影响最大，其发病率高、发生范围广，种植区叶斑病和疫病可使草果产量损失20%～30%，严重的年份可达50%以上。目前怒江州草果叶斑病类病害发生总面积达1.67×104ha，平均每年损失草果5030 t（Qin et al.，2021），因此，对草果叶斑类病害的防控技术进行深入研究，对于指导该病害的科学用药和高效防治具有重要意义。【前人研究进展】新型药剂不仅具有杀菌谱广、低毒、低残留、内吸型降解快的优良特点，还具有不同程度的植物生长调节保护作用，是作物绿色防控的重点研究目标（Ma et al.，2018）。Yao等（2018）研究表明，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂通过影响病菌电子传递继而导致其能量供应不足，从而抑制病菌呼吸作用影响其生长，该类杀菌剂的杀菌谱广且与菌剂无交互抗性，对植物叶部炭疽病具有较高的防控效果；
马云云等（2020）研究结果显示，咪鲜胺对胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌丝生长有明显的抑制作用；
刘世江等（2020）研究表明丙环唑对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）具有较强的抑制活性，且病菌对丙环唑的敏感性较高，不受菌株地理来源的影响。另外，新型高活性药剂具有低残留和降解快等特点，对人体不会产生不可接受的膳食风险。Sefiloglu等（2021）研究表明嘧菌酯可防控茄子叶斑病，且种植过程中最终检出残留量＜0.01～1.61 mg/kg，远低于国家膳食风险标准，评估为较安全的食用级可施用杀菌剂。同时，新型高效杀菌剂之间的合理配伍联用不仅能延长病原菌产生抗药性的时间，还能提高单一药剂的防治效果，节省成本。谢立等（2020）研究表明咪鲜胺与微生物菌剂枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Czk1复配对橡胶炭疽病菌（C.gloeosporioides）的抑菌活性具有明显增效作用；
Cao等（2021）研究表明甾醇脱甲基抑制剂（DMIs）对子囊菌和半知菌引起的多种真菌病害防效最好，但频繁使用易产生抗药性，而与咪鲜胺和苯醚甲环唑复配可达到178的增效系数，可在显著降低药剂使用量的同时达到较长的防治时效；
周艾艾等（2021）田间试验结果显示丙环唑与肟菌酯组合对水稻纹枯病菌具有较好的协同防治效果，且可极大减少药剂使用量。【本研究切入点】民间草果种植一直沿袭传统模式，至今大部分地区仍处于半野生栽培状态，缺乏科学的栽培管理方法与病害防治措施，而化学药剂在病害暴发的应急防治方面具有较大优势，管理方式更为广泛、及时、高效。目前，尚未见有关草果叶斑病类病害防治药剂敏感性以及针对当地优势致病型菌株进行药剂筛选的研究报道，缺乏化学单剂及单剂复配对草果叶斑病类病害防效的综合性研究。【拟解决的关键问题】以3种草果叶斑类病害（炭疽病、叶瘟病和叶斑病）的强致病菌［炭疽菌（Colletotrichumsp.）、灰梨孢菌（Pyricularia grisea）和茎点霉（Phomasp.）］为材料，采用菌丝生长速率法测定6种药剂（嘧霉胺、腈菌唑、咪鲜胺、代森锰锌、嘧菌酯和吡噻菌胺）对草果叶斑病类致病菌株的敏感性和毒力变异系数，分析药剂间的交互抗性，旨在筛选出对草果叶斑类病害防效和安全性较好的药剂及组合，为草果叶斑类病害的绿色防控和生态种植提供科学依据。
1.1 试验材料
1.1.1 供试病菌从怒江州草果主产区泸水市、福贡县和贡山县等10个草果产区采集病害样品共30份进行病原菌分离纯化，依照柯赫氏法则进行回接鉴定，获得引起3种草果叶斑类病害（炭疽病、叶瘟病和叶斑病）的强致病菌25份，其中炭疽菌属8份、灰梨孢菌5份、茎点霉12份，保存于PDA斜面培养基，置于4℃保存备用。
1.1.2 供试药剂400 g/L嘧霉胺悬浮剂（拜耳作物科学有限公司）；
40%腈菌唑悬浮剂（福建新农大正生物工程有限公司）；
40%咪鲜胺水乳剂（山西泓洋化工有限公司）；
80%代森锰锌可湿性粉剂（安道麦股份有限公司）；
240 g/L嘧菌酯悬浮剂（世科姆作物科技有限公司）；
20%吡噻菌胺悬浮剂（世科姆作物科技有限公司）。
1.1.3 培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：葡萄糖20 g、土豆200 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL。
1.1.4 主要仪器GR60DA电热压力蒸汽灭菌锅（致微仪器有限公司）；
SW-CJ-1FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；
DHP-9051微生物培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 药剂对病菌菌丝生长的影响采用菌丝生长速率法测定（冯宝珍和李培谦，2019）。将培养基加热后冷却至50℃左右，分别倒入100 mL无菌锥形瓶中，在预试验的基础上，将6种供试药剂母液稀释成系列浓度，分别加入锥形瓶中均匀搅拌，向每个培养皿内倒入10 mL含药培养基，以不加药剂的PDA培养基为对照，各处理3次重复。将保存的菌种于无菌的PDA培养基中进行活化培养，培养6 d后每份菌株随机选取3个病菌培养基，用打孔器在菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，将菌丝块接种至已凝固的含药培养基及空白对照培养基正中央，于25℃恒温条件下倒置培养，每3 d测量一次菌落直径，直至空白对照组菌落占培养皿的80%。用垂直十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算菌丝生长抑制率。
1.2.2 药剂抑制中浓度（EC50）和变异系数分析采用SPSS 20.0的Probit回归分析计算药剂EC50。以药剂浓度对数值为自变量x，以抑菌率的概率值为因变量y，建立毒力回归方程，通过毒力回归方程计算各药剂EC50，EC50越小则说明该药剂的毒力越强。
采用SPSS 20.0计算病菌对各药剂的毒力变异系数。
式中，X代表3种致病菌，Y代表6种药剂。变异系数代表X病菌对Y药剂的敏感性差异程度，变异系数越大代表Y药剂对X病菌的抑制作用越不稳定，存在较大的个体差异。
1.2.3 交互抗性运用病菌对药剂的EC50对数值进行Spear-man’s秩相关系数分析。若P＜0.05，说明2种药剂间存在交互抗性；
P＞0.05，则说明2种药剂间无交互抗性，可复配或交替使用（Cao et al.，2021）。
1.3 统计分析
运用SPSS 20.0对试验数据进行单因素方差分析，试验数据以x±s表示，用Duncan’s新复极差法进行数据差异显著性检验（α=0.01），用Excel 2017绘制图表。
2.1 草果炭疽病菌对6种药剂的敏感性和毒力变异系数测定结果
对6种药剂的毒力敏感性测定结果（表1）显示，吡噻菌胺各浓度对草果炭疽菌的抑制作用均较强，对病菌菌丝生长抑制率均在61.68%以上，最高达93.57%；
吡噻菌胺和咪鲜胺对病菌的EC50最小、毒力最强，且与其他药剂的EC50差异显著（P＜0.05，下同）。吡噻菌胺对病菌的EC50为0.03～0.07μg/mL，平均值为0.04μg/mL；
咪鲜胺对病菌的EC50为0.05～0.09μg/mL，平均值为0.08μg/mL；
嘧霉胺和代森锰锌对病菌的EC50最大、毒力较弱，嘧霉胺的EC50平均值为26.71μg/mL，与毒力最强的吡噻菌胺的EC50相差约667.75倍。草果炭疽菌对各药剂的毒力变异系数测定结果（表1）显示，吡噻菌胺和咪鲜胺对病菌的毒力变异系数最大，分别为31.22%和25.50%，2种药剂的毒力虽然最强，但对病菌的抗性存在较大的个体差异；
嘧霉胺、代森锰锌和晴菌唑对病菌的毒力变异系数较小，对病菌的抗性较稳定。
表1 草果炭疽菌对6种药剂的敏感性和毒力变异系数Table 1 Sensitivity and coefficients of variation of virulence of Colletotrichum sp.from Amomum tsao-ko to 6 medicaments
2.2 草果叶瘟病菌对6种药剂的敏感性和毒力变异系数测定结果
对6种药剂的毒力敏感性测定结果（表2）显示，咪鲜胺和吡噻菌胺对草果灰梨孢菌的EC50最小，毒力最强，且与其他药剂的EC50显差异著。咪鲜胺对病菌的EC50为1.28～1.77μg/mL，平均值为1.66μg/mL；
吡噻菌胺对病菌的EC50为2.18～4.25μg/mL，平均值为3.15μg/mL；
嘧霉胺和嘧菌酯对病菌的EC50最大、毒力较弱，嘧霉胺和嘧菌酯的EC50平均值分别为43.61和41.60μg/mL，与毒力最强的咪鲜胺的EC50相差26.27和25.06倍。毒力变异系数测定结果（表2）显示，吡噻菌胺对病菌的毒力变异系数最大，为22.30%，咪鲜胺和嘧霉胺的毒力变异系数次之，分别为12.49%和13.46%，咪鲜胺和吡噻菌胺的毒力虽然最强，但对病菌的抗性存在较大的个体差异；
晴菌唑的毒力变异系数较小，对病菌的抗性较稳定。
表2 草果灰梨孢菌对6种药剂的敏感性和毒力变异系数Table 2 Sensitivity and coefficients of variation of virulence of P.grisea from Amomum tsao-ko to 6 medicaments
2.3 草果叶斑病菌对6种药剂的敏感性和毒力变异系数测定结果
对6种药剂的毒力敏感性测定结果（表3）显示，嘧菌酯对草果茎点霉的抑制效果较好，对病菌菌丝的生长抑制率最高达93.34%。各药剂对病菌的EC50均较低，EC50介于0.17～4.99μg/mL。咪鲜胺和嘧菌酯对病菌的EC50最小、毒力最强，且与其他药剂的EC50差异显著；
咪鲜胺对病菌的EC50为0.14～0.23μg/mL，平均值为0.17μg/mL；
嘧菌酯对病菌的EC50为0.28～0.42μg/mL，平均值为0.32μg/mL；
代森锰锌对病菌的EC50最高、毒力最弱。毒力变异系数测定结果（表3）显示，吡噻菌胺和咪鲜胺对病菌的毒力变异系数最大，分别为14.37%和13.14%，2种药剂对病菌的抗性存在较大的个体差异；
代森锰锌对病菌的毒力变异系数最小，对病菌的抗性较稳定。
表3 草果茎点霉对6种药剂的敏感性和毒力变异系数Table 3 Sensitivity and coefficients of variation of virulence of Phoma sp.from Amomum tsao-ko to 6 medicaments
2.4 不同药剂毒力交互抗性分析结果
各药剂对3种病菌的lgEC50相关性分析结果（表4）显示，咪鲜胺、晴菌唑和吡噻菌胺3种药剂间极显著相关（P＜0.01，下同），药剂间存在较大的交互抗性；
咪鲜胺与晴菌唑的相关系数为0.827、与吡噻菌胺的相关系数为0.922，晴菌唑与吡噻菌胺的相关系数为0.770。咪鲜胺和吡噻菌胺分别与嘧霉胺、代森锰锌、嘧菌酯之间无显著相关性（P＞0.05），药剂间无交互抗性。
表4 各药剂间毒力的相关系数分析Table 4 Correlation coefficent analysis of virulence between medicaments
在杀菌剂新品种研发层面，高活性杀菌剂如甲氧基丙烯酸酯类、嘧啶胺类、酰胺类和三唑类杀菌剂等相继取得重大突破，这些杀菌剂对生态环境友好，较少造成污染残留，且具有特定的反应机理，适宜大面积应用于植物病害防治。一些病害如霜霉病、灰霉病、水稻稻瘟病和水稻纹枯病等难以防治的病害用这类杀菌剂治疗有特效。绿色农用杀菌剂是未来杀菌剂发展的必然趋势（Chen et al.，2020；
张恒等，2021）。
本研究结果显示，吡噻菌胺和咪鲜胺对炭疽菌及灰梨孢菌2种病菌的毒力最强，且与其他药剂的EC50差异显著，研究结果与部分炭疽病防控药剂筛选结果相似。如Zhang等（2017）研究表明咪鲜胺对辣椒炭疽病菌的EC50为0.053μg/mL，且通过毒力敏感基线和频率图分析发现，除少数野生种源外，炭疽菌对甾醇脱甲基型抑制剂（DMIs）的抗药风险较低；
Wei等（2020）研究表明45%咪鲜胺对辣椒炭疽病菌的抑制效果最好，田间防效达80.26%；
Mora-Aguilera等（2021）研究表明500 mg/mL咪鲜胺水分散粒剂对芒果炭疽病菌株的抑菌效果最好，平均EC50仅为0.03μg/mL。另外，研究显示新型防控药剂除具有杀菌谱广的特点外，还具有低残留和降解快的优良特点。Noh等（2019）对连续施用吡噻菌胺的紫苏叶进行农药残留分析，结果表明吡噻菌胺代谢率较高，残留物持久性为4.9%，根据食品安全国家标准确定其健康风险较低，评估为较安全的高效杀菌剂。因此，新型高效低毒的咪鲜胺和吡噻菌胺药剂可作为草果叶斑病类病害的绿色防控药剂，可用于对草果叶炭疽病和叶瘟病的综合防控。
本研究中茎点霉对供试6种药剂的敏感性均较强，各药剂对病菌的EC50均较低，介于0.17～4.99μg/mL，其中以咪鲜胺和嘧菌酯的毒力最强。Pintore等（2018）研究表明咪鲜胺对油棕草茎点霉的毒力最强，EC50为1.45 mg/L，防控效果最好；
Zamani-Noor和Knüfer（2018）研究表明，25%嘧菌酯对油菜茎点霉的EC50最低，为0.66μg/mL，且田间试验中平均防效达86.81%。另外，研究表明新型药剂还具有不同程度的植物生长调节保护作用。Navathe等（2020）研究结果显示嘧菌酯不仅有效降低了小麦叶斑病发病率，且显著增加了谷粒日积累量和干物重，提高了小麦产量。目前市面上所推广的嘧菌酯价格相对较低，适宜农户在草果叶斑类病害的防治中使用。
单一连续使用同类杀菌剂时病原菌容易产生抗药性，导致防效下降，混剂可增加对病害的综合防控效果。本研究不同药剂交互抗性分析结果显示，咪鲜胺和吡噻菌胺分别与嘧霉胺、代森锰锌、嘧菌酯间无显著相关性，药剂间无交互抗性。前期研究结果显示咪鲜胺与氟啶胺以3∶1和6∶1的比例混合可对炭疽菌孢子抑制产生协同效应，而以1∶6或1∶3混合可产生增效效应（Patel et al.，2019）。Zhang等（2019）对咪鲜胺与菌核净复配的研究表明，混合药剂可提升对致病菌的刺激度，2种杀菌剂的混合物对细胞膜渗透性的影响具有增效效应，对致病菌抑制效率显著提高。因此，选择吡噻菌胺和咪鲜胺分别与嘧霉胺、代森锰锌、嘧菌酯复配或轮换使用，可避免病菌产生抗药性，同时达到科学、广泛、高时效的防治效果。
目前，尚未见草果叶斑类病害新型低毒药剂筛选与评价的相关报道。本研究通过测定6种药剂对3种草果叶斑类病害致病菌株的敏感性和毒力变异系数，并分析药剂间的交互抗性，综合筛选出具有较高防控效果的药剂及组合，对于指导草果叶斑类病害的田间科学用药和高效防治具有重要意义。但目前咪鲜胺及药剂组合仅在怒江州草果部分种植区施用，实际应用效果还需在多个试验地进一步验证，下一步也需从多角度分析致病菌对新型防控药剂的生理响应以阐明其抑菌机理。此外，草果叶斑病类病害防控应贯彻“预防为主，综合治理”的方针。加强病害预测预报，建立监测网络体系，全面、及时、准确地通报草果病害发生动态，在染病初期结合药剂及时根治，避免草果叶斑病类病害大面积发生，以确保草果的产品质量，实现稳产高产。
吡噻菌胺和咪鲜胺可作为草果叶斑病类病害的新型低毒防控药剂，2种药剂与嘧霉胺、代森锰锌、嘧菌酯复配具有较好的协同效果，可减少药剂使用量且避免病菌产生抗药性，达到高效防控草果叶斑类病害的效果。吡噻菌胺和咪鲜胺单剂分别与嘧霉胺、代森锰锌、嘧菌酯的复配剂可作为草果叶斑病类病害的新型低毒防控药剂在草果生态种植中推广使用。
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