刘传和，贺 涵，邵雪花，赖 多，匡石滋，肖维强
(广东省农业科学院 果树研究所，农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室，广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广州 510640)
菠萝[Ananascomosus(L.) Merr.]又称凤梨，属凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属(Ananas)多年生草本作物，是著名的热带水果，在中国广东、广西和海南等地有较大面积种植。菠萝果实中含有丰富的维生素、碳水化合物和有机酸，叶片具有抗肿瘤、降血糖、调血脂等功效；
菠萝果实既可以鲜食又可加工成饮品、果酱和水果罐头，深受消费者喜爱[1-2]。
中国菠萝品种结构极为单一。20世纪50年代至今，中国菠萝主栽品种仍是‘巴厘’和‘无刺卡因’，其中‘巴厘’品种的种植面积占了中国种植面积的80%。通过杂交和芽变选种选育出具有良好鲜食特性和较好抗逆性的新品种是菠萝的主要育种目标之一[3-4]。‘粤甜’是由‘无刺卡因’与‘神湾’为亲本通过杂交选育的菠萝新品种。‘粤甜’在植株外观形态方面与‘神湾’较为接近，但‘粤甜’菠萝果实比‘神湾’稍大。经过多年生产种植表明，‘粤甜’菠萝的品质与抗逆性均明显优于‘神湾’。
有关菠萝抗逆性，多从表型进行研究。马帅鹏等[5]根据寒害等级对4个菠萝品种‘金菠萝’(MD-2)、‘黄金菠萝’、‘巴厘’、‘无刺卡因’进行了寒害调查，比较了不同菠萝品种的抗寒性差异。Shu等[6]以耐冷品种MD-2和冷敏感品种‘台农17’为材料，寻找和筛选了耐冷基因同源序列附近的SSR位点，对所收集的种质进行耐冷性鉴定分类。近年来随着转录组、代谢组等测序技术的使用，为农作物育种与深入研究新品种(系)优异性状形成的机理提供了方便。转录组与代谢组联合分析已广泛应用于水稻[7]、玉米[8]、辣椒[9]、火龙果[10]等作物不同生长发育时期和逆境胁迫下差异表达基因、差异代谢物的筛选与鉴定等相关研究，也逐渐成为果树遗传育种中相关分子机理和代谢途径研究的重要手段[11]。本研究基于转录组和代谢组结果对‘神湾’和‘粤甜’两个具有抗逆性差异的菠萝品种间差异表达基因和差异代谢物进行了分析，旨在探明‘粤甜’菠萝抗逆性形成的分子生理基础，为菠萝抗逆性相关分子机理和抗性育种提供参考，也有利于加快菠萝抗性育种进程。
1.1 试验材料
本试验在广东省农业科学院果树研究所菠萝试验示范基地进行。供试品种‘神湾’(PZ2)和‘粤甜’(PZ3)，PZ2为对照。每个品种种植3个小区，随机排列。每个小区长6 m，宽1 m，株、行距为30 cm×40 cm。2020年4月，在每个小区中选择长势一致的菠萝植株3棵，每棵选取3片中部叶片，摘取叶片中间部位5 cm长作为取样部位。每个小区植株上取的叶片混合为1个样品，3个小区即为3次重复。取样后立即置于液氮中速冻，2 h后在-70 ℃超低温冰箱中暂存，用于转录组和代谢组分析。
1.2 转录组分析
1.2.1 总RNA提取与转录组测序总RNA提取及转录组测序委托百迈客生物科技有限公司完成，3次生物学重复。采用天根DP441(RNAprep Pure Plant Kit，Polysaccharides & Polyphenolics-rich)试剂盒进行总RNA提取，检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，加入裂解缓冲液(Fragmentation Buffer)将mRNA随机打断，以mRNA为模板，用6碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA 聚合酶Ⅰ合成第二条cDNA链，并利用AMPure XP beads纯化cDNA。将纯化的双链cDNA进行末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads进行片段大小选择，通过PCR富集得到cDNA文库。文库构建完成后，通过qRT-PCR方法对文库有效浓度(文库有效浓度>2 nmol/L)进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，不同文库按照目标下机数据量进行混池，并使用Illumina平台进行测序。
1.2.2 差异表达基因筛选与分析采用DESeq2[12]进行基因差异表达分析。将差异显著性P值校正后得到的错误发现率(false discovery rate，FDR)与差异倍数(fold change，FC)相结合的方法进行差异表达基因筛选，筛选标准为FC≥2且FDR<0.01。
1.2.3 部分差异表达基因qRT-PCR验证选择8个差异表达基因和内参基因Actin进行qRT-PCR表达分析，用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1)，用2-ΔΔCt方法计算基因表达水平。用Excel 2007将qRT-PCR结果与RNA-seq测定的FPKM[13]比较作图。
表1 qRT-PCR分析基因及引物
1.3 代谢物提取与分析
1.3.1 代谢物提取利用研磨仪(MM 400，Retsch)将真空冷冻干燥的样品研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末状，称取100 mg粉末，溶解于0.6 mL提取液中，4 ℃冰箱过夜，期间涡旋6次以提高提取率。离心(转速10 000 g，10 min)后，吸取上清，用微孔滤膜(0.22 μm)过滤，并保存于进样瓶，用于UPLC-MS/MS分析。
1.3.2 色谱条件色谱柱为Agilent SB-C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；
流动相A为超纯水(加入0.1%的甲酸)，B为乙腈。洗脱梯度为B相比例为5%，9 min内B相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，10～11.1 min B相比例降为5%，并以5%平衡至14 min，流速0.35 mL/min，柱温40 ℃，进样量4 μL。
1.3.3 质谱条件电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度550 ℃，质谱电压5 500 V，帘气(curtain gas，CUR)30 psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，CAD)参数设置为高。
1.3.4 差异代谢物筛选与分析基于UPLC-MS/MS检测平台、百迈客公司自建数据库以及多元统计分析相结合对代谢组进行分析。通过主成分分析(principal component analysis，PCA)样品总体代谢差异和组内变异程度。采用R(3.3.2)包ropls对代谢物进行正交偏最小二乘模型识别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)。将差异倍数、t检验的P值和OPLS-DA模型的变量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)值相结合筛选差异代谢物；
筛选标准为FC>1.50、P<0.05和VIP>1。将筛选得到的差异代谢物与差异表达基因进行关联分析。
2.1 差异表达基因分析
2.1.1 差异表达基因数据统计对PZ2和PZ3间差异表达基因分析，将FC≥2且FDR<0.01作为筛选标准，共筛选得到差异表达基因1 667个，其中上调的为770个，下调的为897个，其差异表达见图1。
Up. 上调基因；
Down. 下调基因；
Normal. 无差异基因
2.1.2 差异表达基因筛选在PZ2与PZ3比较中，筛选出20个与抗逆性相关差异表达基因(表2)，包括超氧化物歧化酶SOD1、过氧化物酶POD48等酶基因，抗病蛋白RPP13、抗病蛋白RPP8和脱落酸胁迫诱导成熟蛋白ASR3等抗性相关蛋白基因，以及MYB、WRKY等转录因子基因。PZ3中SOD1、POD48、POD31、ALDH2、TR、GSTU17等9个酶基因的表达是PZ2的1.09～3.10倍。抗病蛋白RPP13-like、硝酸盐转运蛋白NRT1/PTR FAMILY 5.10-like、核糖体蛋白L38-like等蛋白基因在PZ3中的表达是PZ2的1.08～6.97倍。MYB、WRKY等转录因子基因在PZ3中的表达是PZ2的1.20～1.84倍。
表2 关键差异表达基因的筛选
2.1.3 部分差异表达基因qRT-PCR验证图2所示为部分差异表达基因的qRT-PCR验证。结果表明，8个差异表达基因(LOC109726005、LOC109705050、LOC109703989、LOC109720393、LOC109704375、LOC109720819、LOC109721892、LOC109705329)在PZ2与PZ3中的差异表达趋势与转录组测序中差异基因表达水平变化趋势基本一致。
图2 差异表达基因qRT-PCR验证
2.2 差异代谢物分析
2.2.1 差异代谢物火山图分析以FC>1.50、P<0.05和VIP>1为筛选标准，在PZ2和PZ3样本间共筛选到208个差异代谢物，其中，与PZ2相比，PZ3中有98个上调，110个下调(图3)。
Up. 上调代谢物；
Down.下调代谢物；
Unchanged. 无变化代谢物
2.2.2 差异代谢物的筛选在PZ2和PZ3比较组间共筛选到22种与抗逆性显著相关的差异代谢物，包括16种黄酮类物质，3种氨基酸及其衍生物，2种脂类和1种木脂素(表3)。
表3 关键差异代谢物的筛选
与PZ2相比，16种黄酮类代谢物在PZ3中的含量上调了6.22～18.43倍。3种氨基酸及其衍生物L-脯氨酸、顺式-4-羟基-D-脯氨酸、甲基槲皮素谷氨酸在PZ3中的含量分别较PZ2提高了1.30倍、1.10倍和16.54倍。木质素代谢物松脂醇-乙酰葡萄糖在PZ3中的含量较PZ2上调了10.52倍，脂质类代谢物4-氧代-9Z,11Z,13E,15E-十八碳四烯酸、溶血磷脂酰胆碱分别较PZ2上调了1.40倍和1.57倍。
2.3 差异表达基因和差异代谢物关联分析
通过对PZ2和PZ3差异表达基因和差异代谢物进行关联分析发现，共有4条共同富集的通路(表4)，分别为类黄酮生物合成，苯丙素生物合成，莨宕烷、哌啶和吡啶丙酸盐生物合成，半胱氨酸与蛋氨酸代谢。代谢组与转录组联合分析表明，类黄酮生物合成途径中的差异表达基因与差异代谢产物圣草酚、表没食子儿茶素的合成密切相关。苯丙素生物合成途径中过氧化物酶基因、乙醛脱氢酶基因、莽草酸-O-邻羟基肉桂酰转移酶基因、4-香豆酸-辅酶A连接酶基因与与差异代谢产物亚精胺和苯丙氨酸的合成密切相关。关联结果表明，过氧化物酶基因上调，亚精胺含量升高，呈正相关；
半胱氨酸与蛋氨酸代谢途径中的差异表达基因1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶与差异代谢产物L-蛋氨酸、L-类胱氨酸和5′-脱氧-5′-(甲硫基)腺苷的合成密切相关，基因上调，差异代谢产物含量升高，呈正相关。
表4 差异表达基因和差异代谢物关联分析
转录组分析表明，与PZ2相比较，在抗逆性较强品种PZ3中筛选到1 667个差异表达基因，其中770个表达上调，897个表达下调，表明抗逆性不同的菠萝品种在转录水平存在明显差异。
超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)是细胞膜系统损伤修复过程中的关键酶，在提高植株对逆境的适应性中发挥着积极作用，具有抗氧化活性，延缓衰老[14]。本研究中，与PZ2相比较，PZ3中SOD1和POD48等基因的表达量明显上调，抗逆性强品种通过产生活性氧消除相关酶与还原物质来消除非生物逆境胁迫，以减轻外界胁迫对植株的损伤。类似地，乙醛脱氢酶、托品酮还原酶、4-香豆酸-辅酶A连接酶、ACO、GSTF1、GSTU17等酶基因在PZ3中的表达也明显高于PZ2，有利于增强PZ3对逆境胁迫的抗性[15-19]。而一些蛋白基因如抗病蛋白RPP13-like、硝酸盐转运蛋白、核糖体蛋白、脱落酸胁迫诱导成熟蛋白、热激蛋白以及热激转录因子等基因也在PZ3中的表达高于PZ2，能提高PZ3对逆境的适应性与抵抗力[20-24]。WRKY和MYB转录因子基因在调控植物生长发育及响应低温、干旱等逆境胁迫过程中发挥着重要的作用[25-29]，是响应非生物胁迫过程中的关键调控基因[26-28]。本研究中抗逆性较强的品种中WRKY26和MYB的表达量高于抗逆性差的品种。
代谢组分析表明，在PZ2和PZ3比较组中筛选到208个差异代谢物， PZ2和PZ3差异代谢物在氨基酸类和黄酮类代谢过程中较为活跃。转录组与代谢组联合分析也表明类黄酮生物合成、苯丙素生物合成、莨宕烷、哌啶和吡啶丙酸盐生物合成、半胱氨酸与蛋氨酸代谢4条通路中的差异表达基因与差异代谢物呈明显正相关，说明PZ2和PZ3两个不同品种菠萝抗逆性的差异与氨基酸类、黄酮类物质的合成以及代谢有关[29]。
黄酮类、氨基酸衍生物类以及木脂素类代谢物是植物抗逆性的重要影响物质[30-31]。本研究中，抗逆性较强的菠萝品种中黄酮类、氨基酸衍生物类及木脂素、脂质等代谢物的含量高于抗逆性较差的品种，菠萝的抗逆性与以上代谢物质的积累有关。4-氧代-9Z,11Z,13E,15E-十八碳四烯酸和溶血磷脂酰胆碱分别属于脂肪酰基类和甘油磷脂类物质，是细胞膜的重要组成成分，在抵御植物低温胁迫过程中发挥着重要作用[32]，这两种代谢物在PZ3中含量高于PZ2，能提高PZ3的抗逆性。黄酮类物质作为一类抗氧化剂，在植物应对低温等逆境时能有效清除细胞中的活性氧，提高植株免疫力[29,33]。本研究中，筛选到的16种黄酮类差异代谢物在抗逆性较强的品种中的含量均显著高于抗逆性较差品种，说明抗氧化相关化合物的积累有利于提高菠萝的抗逆性[34]。可溶性糖和脯氨酸等是常见的渗透保护物质，其含量的积累有助于维持低温、盐和干旱等逆境胁迫下细胞膜的流动性和稳定性，降低渗透压力的损害[35-36]。本研究中，松脂醇-乙酰葡萄糖及脯氨酸类代谢物在PZ3中的含量高于PZ2，均有利于提高PZ3对逆境的适应性与抗逆性。
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