李玲玲，陈盛君，李松，祝倩倩，王协和，李媚，文红梅
1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；
2.江阴天江药业有限公司技术中心，江苏 江阴 214434；
3.江苏省中药配方颗粒制备与质量控制关键技术重点实验室，江苏 江阴 214434；
4.江苏省中药配方颗粒工程技术中心，江苏 江阴 214434
半夏厚朴汤出自汉代张仲景的《金匮要略》，全方由半夏、厚朴、茯苓、紫苏和生姜组成，具有行气散结、降逆化痰的功效，是治疗因情志不遂、肝气郁滞、痰气互结、停聚于咽所致“梅核气”的经典名方[1]。“梅核气”多发于成年女性，常见于现代医学的咽神经官能症、咽异感症、慢性咽炎等[2]。现代临床研究表明，半夏厚朴汤还具有治疗胃食管反流病、慢性胃炎、功能性消化不良、哮喘、咳嗽、慢性咽炎及抑郁等作用，尤其在抗抑郁及改善胃肠功能等方面效果显著[3-9]。
关于半夏厚朴汤的研究多集中于复方加减联合化学药的现代临床应用，目前尚未有其物质基准量值传递的相关文献报道。本研究以半夏厚朴汤为研究对象，选取道地产区和主产区多批样品，按照古法进行煎煮，制备物质基准，建立复方超高效液相色谱法（UPLC）特征图谱，以野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚为定量指标，建立半夏厚朴汤物质基准质量标准，为后续制剂的工艺研究和质量控制提供参考。
1.1 仪器
2L-YMW 型机械分体煎药壶（潮州市港钿工艺制作厂）；
JE502 型电子天平、JSB3-01 型电子秤（上海浦春计量仪器有限公司）；
ACQUITY-UPLCH-Class 型色谱仪（Waters 公司）；
Vanquish F 型超高效液相色谱仪（Thermo 公司）；
ME204 型百万分之一电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；
KQ-250DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
TGL-16C型高速台式离心机（无锡楼兰仪器系统有限公司）；
PO Lab plus-L 型纯水系统（Satorius公司）。
1.2 试药
对照品野黄芩苷（批号：110842-201709，纯度：91.7%）、迷迭香酸（批号：111871-201505，纯度：98.5%）、厚朴酚（批号：110729-201714，纯度：100.0%）、和厚朴酚（批号：110730-201614，纯度：99.3%）、咖啡酸（批号：110885-200102，纯度：99.7%）、6-姜辣素（批号：111833-202007，纯度：99.3%）均购自中国食品药品检定研究院；
木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS000711，纯度＞95%）；
甲醇、乙腈、磷酸、甲酸均为色谱纯；
水为超纯水；
其他试剂均为分析纯。
本研究所用的半夏、厚朴、茯苓、紫苏叶、生姜均购于各自道地产区或主产区，经江阴天江药业有限公司工程师唐波鉴定，半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎，厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥树皮、根皮及枝皮，茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，紫苏叶为唇形科植物紫苏Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥叶，生姜为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎。利用Excel 表格随机组合方式形成15 批半夏厚朴汤饮片组合，编号为S1～S15（表1）。
表1 15批半夏厚朴汤饮片信息
2.1 物质基准的制备
通过饮片炮制、处方剂量考证确定处方药味及用量，根据《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》及古籍记载内容[10]，对煎煮瓦数、滤过目数、是否加盖、浓缩温度4个因素进行考察，确定半夏厚朴汤物质基准制备的工艺参数。
注：15批生姜的产地均为云南。
按处方比例分别称取姜半夏15 g、姜厚朴9 g、茯苓12 g、紫苏叶6 g、生姜15 g 置于煎药壶中，加水1400 mL，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持沸腾至约800 mL，过200 目筛，65 ℃条件下减压浓缩至约580 mL，冷冻干燥得半夏厚朴汤冻干粉（1 g冻干粉相当于7.03～12.62 g生药量）。同法制备多批冻干粉及缺姜半夏阴性样品、缺姜厚朴阴性样品、缺茯苓阴性样品、缺紫苏叶阴性样品、缺生姜阴性样品及各单味药样品。
2.2 特征图谱的建立
2.2.1色谱条件 采用ZORBAX Eclipse Plus C18RRHD 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm），甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～13 min，2%～17%A；
13～19 min，17%A；
19～38 min，17%～34%A；
38～42 min，34%A；
42～55 min，34%～40%A；
55～68 min，40%～90%A）；
流速为0.3 mL·min-1；
柱温为25 ℃；
进样量为2 μL；
检测波长为280 nm。
2.2.2供试品溶液制备 取本品冻干粉约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。同法分别制备缺姜半夏、缺姜厚朴、缺茯苓、缺紫苏叶、缺生姜阴性样品溶液。
2.2.3精密度试验 取半夏厚朴汤物质基准（S1）供试品溶液，按照2.2.1 项下色谱条件重复进样6次，计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明仪器精密度良好。
2.2.4重复性试验 平行制备6 份半夏厚朴汤物质基准（S1）供试品溶液，按照2.2.1 项下色谱条件测定，计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明该方法的重复性较好。
全面训练。高三复习不能只注重重点知识，从今年的高考命题可以看出，有些知识来源于教材的细微之处，如若复习过程不全面，可能会造成重大失误。
2.2.5稳定性试验 取半夏厚朴汤物质基准（S1）供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件分别于供试品溶液制备后0、2、4、6、8、12、18、24、48 h进样测定，计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于5.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.2.615批半夏厚朴汤特征图谱 特征图谱可较全面反映中药复方所含化学成分的种类及数量，实现整体质量控制。按照2.2.2项下方法制备半夏厚朴汤物质基准S1～S15供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录UPLC图，将S1～S15样品色谱图以.cdf格式导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统”（2012版），采用中位数法，时间窗宽度为0.1 min，进行全谱峰匹配，共发现12个共有峰（图1），相对保留时间的RSD均小于2.0%。以对照图谱计算半夏厚朴汤物质基准相似度（表2），S10 相似度＜0.90，其余相似度均大于0.90，测定发现该批和厚朴酚、厚朴酚峰面积较小，可能与不同批厚朴饮片含量差异有关。
表2 15批半夏厚朴汤物质基准共有峰相似度
图1 15批半夏厚朴汤物质基准UPLC特征图谱
2.2.7共有峰归属及指认 根据15 批物质基准特征图谱，共标定了12个共有峰（图1）。通过与对照品比对，指认出峰2为咖啡酸、峰8为野黄芩苷、峰9为迷迭香酸、峰10为6-姜辣素、峰11为和厚朴酚、峰12 为厚朴酚。经指认，峰1 来自姜半夏，峰2、5～9 来自紫苏叶，峰3～4、11～12 来自姜厚朴，峰10来自生姜（图2）。
图2 半夏厚朴汤物质基准、阴性样品、单味饮片、对照品UPLC特征图谱
2.2.8特征图谱分析
2.2.8.1聚类分析（CA）将15 批样品特征图谱的12 个共有峰峰面积处理成量化特征峰数据，采用SIMCA 13.0 软件进行CA。结果显示，15 批样品分为2 类，S3～S6、S8、S14 聚为一类，S1、S2、S7、S9～S13、S15 聚为一类，可能与不同产地饮片之间的配伍有关，其中S3～S6、S8、S14主要由山西运城的姜半夏、四川绵阳的姜厚朴、湖南湘潭的紫苏叶配伍组成。
2.2.8.2主成分分析（PCA）采用SPSS 23.0 软件对15批样品的12个共有峰进行降维因子PCA，提取相关性矩阵数据（表3）。结果显示，15 批半夏厚朴汤物质基准提取到了3个主成分。
表3 15批半夏厚朴汤样品PCA矩阵
2.2.8.3正交偏最小二乘法-判别分析（OPLSDA）将15 批样品的12 个共有峰峰面积导入SIMCA 13.0软件进行OPLS-DA，选择3个主成分，其模型关键参数：模型对X矩阵的解释率（R2X）、模型对Y矩阵的解释率（R2Y）、模型的预测能力（Q2）值分别为0.803、0.925、0.829，说明该模型具有较好的拟合能力及预测能力。OPLS-DA得分图（图3）中，15批样本聚为2类，与CA结果一致。OPLS-DA载荷图中，圆点距离原点越远，表明色谱峰权重值越大，对样本的影响越大，根据OPLS-DA载荷图（图4），F9、F8、F4距离原点较远，为主要影响成分。模型中变量重要性投影（VIP）值图（图5）中，一般认为VIP值＞1的色谱峰对样本的影响较大，为主要差异成分。综合图4～5，筛选出对样本影响较大的4个色谱峰，按影响程度依次为F9＞F8＞F3＞F4，其中F3、F4经质谱也未解析出其成分。
图3 半夏厚朴汤样品OPLS-DA得分图
图4 半夏厚朴汤样品OPLS-DA载荷图
图5 半夏厚朴汤样品OPLS-DA VIP值
2.3 含量测定
本研究综合特征分析筛选出的对样本影响较大的色谱峰及处方发挥药效作用的有效成分，以野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚为指标成分，建立半夏厚朴汤物质基准的含量测定方法。
2.3.1色谱条件 野黄芩苷采用Acclaim ™RSLC Polar Advantage Ⅱ（PA2）色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.2 µm），以乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～17 min，15%A；
17～18 min，15%～70%A）；
流速为0.3 mL·min-1；
柱温为30 ℃；
进样量为2 μL；
检测波长为330 nm。迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚按2.2.1项下色谱条件测定。
2.3.2供试品溶液制备 按照2.2.2 项下方法制备半夏厚朴汤物质基准供试品溶液。
2.3.3对照品溶液制备 取野黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成野黄芩苷质量浓度为9 μg·mL-1的溶液，即得野黄芩苷对照品溶液。取对照品迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚适量，精密称定，加50%甲醇制成迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚质量浓度分别为22、10、10 μg·mL-1的混合对照品溶液。
2.3.4线性关系考察 取野黄芩苷对照品溶液，按照2.3.1 项下色谱条件进样，进样体积分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 μL；
取迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚混合对照品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样，进样体积分别为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μL，测定峰面积，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线（表4）。
表4 野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚线性关系
2.3.5精密度试验 取同一半夏厚朴汤物质基准（S1）供试品溶液，分别按2.3.1 及2.2.1 项下色谱条件连续进样6 次，计算供试品溶液中野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚峰面积的RSD 均小于2.0%，表明仪器精密度良好。
2.3.6重复性试验 平行制备6 份半夏厚朴汤物质基准（S1）供试品溶液，分别按2.3.1及2.2.1项下色谱条件进样，计算供试品溶液中野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚含量的RSD 均小于2.0%，表明各指标成分方法重复性良好。
2.3.7稳定性试验 取半夏厚朴汤物质基准（S1）供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0、2、4、6、8、12、18、24、48 h 按2.2.1 项下色谱条件测定，计算供试品溶液中迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚48 h 峰面积的RSD；
按2.3.1 项下色谱条件测定，计算供试品溶液中野黄芩苷24 h 峰面积的RSD，结果均小于2.0%，表明迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚在供试品溶液制备后48 h 内稳定性良好，野黄芩苷在供试品溶液制备后24 h内稳定性良好。
2.3.8加样回收率试验 取已知含量的半夏厚朴汤物质基准冻干粉（S1）0.1 g，精密称定，平行9份，分成3 组，依次精密加入野黄芩苷对照品溶液5、10、15 mL（加入比例分别为0.5∶1.0、1∶1、1.5∶1.0），再加入50%甲醇使加入的溶液体积为25 mL，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样分析，计算供试品溶液中野黄芩苷的加样回收率及RSD。加入迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚混合对照品，2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样，计算供试品溶液中迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚的加样回收率及RSD。野黄芩苷、迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚的回收率分别为95.08%、96.49%、98.87%、100.12%，RSD均小于3.0%，表明其含量测定方法准确性良好。
2.3.9专属性试验 取半夏厚朴汤物质基准（S1）供试品溶液、缺紫苏叶阴性样品溶液按2.3.1项下色谱条件测定，得专属性图谱（图6）。表明野黄芩苷专属性良好。迷迭香酸、厚朴酚、和厚朴酚专属性见特征图谱图1。
图6 野黄芩苷专属性图谱
2.4 15批半夏厚朴汤物质基准量值传递分析
2.4.1含量测定 取15 批半夏厚朴汤物质基准冻干粉，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，分别按2.3.1及2.2.1 项下色谱条件测定。按公式（1）计算野黄芩苷、迷迭香酸、和厚朴酚、厚朴酚转移率（表5）。15 批半夏厚朴汤物质基准中，厚朴酚与和厚朴酚总质量分数为0.09%～0.40%，均值为0.24%；
野黄芩苷质量分数为0.13%～0.33%，均值为0.24%；
迷迭香酸质量分数为0.20%～0.74%，均值为0.43%。厚朴酚与和厚朴酚总量的转移率为7.18%～18.96%，均值为11.69%；
野黄芩苷转移率为46.04%～88.30%，均值为62.77%；
迷迭香酸转移率为29.91%～72.94%，均值为51.06%。
表5 15批半夏厚朴汤物质基准4个指标成分的质量分数、转移率、出膏率
由于饮片性状、质地不均，含量差异较大，其溶出率存在一定差别，致使15 批半夏厚朴汤厚朴酚、和厚朴酚总质量分数及转移率范围超出规定范围；
湖南省及湖北省厚朴丝细、质地松软、含量偏低，煎煮时溶出率高，其转移率较高。野黄芩苷、迷迭香酸的转移率基本在均值的70%～130%，其含量离散型数据可能与处方及饮片含量差异有关。
2.4.2出膏率 精密称取半夏厚朴汤物质基准（S1～S15）浓缩液各10 g，置于质量恒定的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥至质量恒定，取出，置于干燥器中冷却30 min，称定质量，按公式（2）计算出膏率。15 批半夏厚朴汤物质基准出膏率为9.01%～15.83%，均值为12.88%，基本在均值的70%～130%，未出现相差较大离散数据。
3.1 物质基准工艺考察
本研究根据半夏厚朴汤物质基准的制备煎煮终点质量考察3 个不同产地复方饮片煎煮30、60、90、100、110、120 min的吸水量，绘制吸水量-时间曲线图，发现复方饮片吸水量1 h后基本趋于稳定，1 h左右的吸水量为82.1 mL。按公式（3）计算理论终点质量。
半夏厚朴汤物质基准的野黄芩苷、迷迭香酸、%厚朴酚、和厚朴酚4 个含量指标分为两类，一类为紫苏叶中的酚酸类及黄酮类成分，一类为姜厚朴中的脂溶性成分，而紫苏叶属于芳香类药物，依据《医疗机构中药煎药室管理规范》中规定解表类、清热类、芳香类药物不宜久煎。考察现代煎煮法与古代煎煮法4 个指标成分的转移率，结果显示，古法煎煮厚朴酚、和厚朴酚转移率高于现代煎煮，现代煎煮野黄芩苷、迷迭香酸转移率高于古法煎煮。古法煎煮时间长，有利于厚朴酚、和厚朴酚脂溶性成分的溶出，现代煎煮法煎煮时间短，有利于紫苏叶中的野黄芩苷、迷迭香酸的保留，这与古法煎煮功率考察结果一致。以经典名方“遵古”为前提，结合半夏厚朴汤的主要药效成分及厚朴为臣药、紫苏叶为佐药的因素，选用古法煎煮制备物质基准。
3.2 野黄芩苷含量测定条件的优化
野黄芩苷与其相邻的木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷的相对分子质量相同，互为同分异构体，对于两者的分离较为困难。前期考察了不同色谱柱（HSS T3、ZORBAX Eclipse Plus C18RRHD、Thermo 苯基柱、Poroshell 120 EC-C18、Thermo Syncronis C18、ZORBAX SB-C18RRHD、CORTECS T3）、不同流动相（甲醇-磷酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、甲醇-乙腈-磷酸水溶液）均很难使野黄芩苷和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷很好地分离。后续采用对苯环羟基有选择性的色谱柱，如Polaris 5 NH2（250 nm）、Acclaim™RSLC Polar Advantage Ⅱ（PA2，100 nm）均可有效分离野黄芩苷和木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷，考虑到长期使用Polaris 5 NH2，色谱柱中的氨基会脱落影响柱效，不宜使用。故野黄芩苷与木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷的分离采用AcclaimTMRSLC PolarAdvantage Ⅱ（PA2）色谱柱。对比不同甲酸酸度（0.05%、0.10%、0.20%）、不同酸（磷酸、冰乙酸、甲酸），发现0.2%甲酸水溶液对野黄芩苷的分离效果较好，确定野黄芩苷含量测定流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液。
半夏厚朴汤用药精炼、组方严谨，具有行气散结、降逆化痰功效，是治疗“梅核气”的经典方剂。为保证经典名方制剂质量疗效一致，需建立从药材到饮片、中间体、制剂全过程的整体质量控制，严格把控制备过程中的质量情况。本研究采用特征图谱、指标性成分含量测定、转移率及出膏率相结合的模式，对经典名方半夏厚朴汤基准的量值传递过程进行分析，初步建立了科学稳定的质量评价方法，可为后续研究及相关制剂的质量控制提供参考。
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