黄润华,安 宇,刘 竞,邱明星
(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.手术室；
b.泌尿外科，四川 成都610072)
导尿管相关性尿路感染(CAUTIs)的患者已经有相当大比例分离出产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的大肠埃希菌(E.coli)，其感染造成的严重不良事件或病死率逐年增高[1]。细菌生物膜(BF)是引起CAUTIs慢性反复致病和耐药最重要机制[2]。ESBLs E.coli耐药的主要机制是产生水解抗生素ESBLs。然而对于生物膜细菌而言，除了产酶机制外，细菌还可能再受到BF“保护”而产生更强或更持续的耐药性。研究表明，尿源性大肠埃希菌和铜绿假单胞菌细菌生物膜菌株的耐药率更高[3]。既往关于CAUTIs相关性ESBLs E.coli BF特点研究甚少，且均基于体外静态BF孵育模型，BF形成能力与BF细菌耐药之间有无相关性暂无报道。本研究将早期耐药菌BF形成作为研究靶点，创新性地体外构建动态模拟膀胱细菌BF模型，在持续感染人工尿液环境下观察BF形成特点和能力，了解BF不同表型(阴性或阳性)与BF细菌耐药性的关系，旨在为临床防治耐药菌BF感染提供理论依据。
1.1 实验材料2016年7月至2020年12月分离自我院门诊部、急诊部及住院部留置导尿管疑似感染送培养ESBLs E.coli报阳标本，编号E1～E46。标准菌株：E.coli 标准菌(ATCC25922)，编号E0；
实验菌株：CAUTIs相关性ESBLs E.coli临床株；
均由我院检验科提供并保存。主要试剂：M-H肉汤、M-H琼脂，结晶紫溶液，人工尿液。主要仪器：VITEK2.0 COMPACT微生物分析仪，麦氏比浊仪，酶标仪，紫外分光光度计，智能型电热恒温培养箱，无菌工作台，低温冰箱，Nikon ECLIPSE Ti 倒置显微镜。
1.2 实验方法
1.2.1细菌鉴定及药敏实验 标准菌株E0和实验菌株E1～E46标本接种于血平皿，培养、纯化，每组中取2个样本，按操作流程上机检测，鉴定为ESBLs E.coli，作11种泌尿外科常用抗生素药敏分析。
1.2.2生物膜形成实验 制备感染人工尿液：直接生长法将保种E0、E1～E46菌株活化、增菌获得对数生长期的纯种菌悬液，比浊法调节浊度值至0.5麦氏单位。配制无菌人工尿液[4]：以人工尿液 1∶100 稀释菌悬液，获得感染人工尿液。菌落数(1.0～2.0)×106CFU/ml。静态BF模型：取12孔培养板，置入盖玻片为载体，加入E1菌株感染人工尿液，每个样本取5个复孔，静置恒温孵育48 h(37 ℃)，每12 h更新培养基。同法做E2～E46菌株BF形成实验。动态BF模型[5]：组建灌流式膀胱细菌BF动态孵育模拟系统[6],于孵育盒内平整置入5张盖玻片，接入动态孵育模拟系统，置入孵箱避光孵育48 h(37 ℃)，开启蠕动泵持续泵入E1感染人工尿液，恒定流速约1.5 ml/min流转。分别所获盖玻片，以1%结晶紫溶液室温下染色，2个样本送显微镜油镜下镜检(10×100倍)，3个样本以酶标仪测定OD630 nm值。实验数值取平均OD值。同法做E2～E46菌株BF形成实验。以上实验均以无菌人工尿液作阴性对照，取平均OD值+3倍标准差为阴性界限OD值。E0 感染人工尿液作阳性对照。
1.3 结果判定[7]①BF形成阳性株：平均OD值>阴性界限OD值。弱阳性：平均OD值<2倍阴性界限OD值，强阳性：平均OD值>2倍阴性界限OD值。②BF形成阴性株：平均OD值<阴性界限OD值。
1.4 统计学方法应用SPSS 20.0统计学软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料比较采用连续性校正χ2检验或Fisher’s精确概率法。α=0.05
2.1 药敏实验情况实验菌株对碳青霉烯类抗生素和替加环素敏感率100%，对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、头孢替坦相对敏感(敏感率>75%)，对其余抗生素均呈现耐药(敏感率<75%)。中介菌株视作耐药菌株处置。见表1。
表1 实验菌株药敏结果[n(%)]
2.2 生物膜形成实验情况静态模型BF阳性率89.13%(41/46)，BF阴性率10.87%(5/46)。动态模型BF阳性率95.65%(44/46)，BF阴性率4.35%(2/46)。动态模型BF阳性株平均OD值显著高于静态模型(P<0.05)。见表2。动态模型试验菌株BF形成结晶紫染色。见图1。
表2 实验菌株BF平均OD值
2.3 生物膜耐药性分析实验菌株静态模型和动态模型BF不同表型(阳性或阴性)对11种抗菌药物耐药率进行分析，其耐药性差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3，表4。
表4 动态模型不同BF表型实验菌株耐药比较率 [n(%)]
CAUTIs最主要的致病菌为肠杆菌科细菌，其中又以E.coli为首。随着抗生素滥用日益严重，临床已经分离出相当大比例的ESBLs E.coli。ESBLs E.coli对包括青霉素类、第三代头孢菌素、单环酰胺类抗生素在内的几乎所有的β-内酰胺类抗生素均耐药[7]。CAUTIs慢性、持续、反复发生及防治困难的根源在于留置导尿管表面形成的BF，阻止致病菌BF形成或破坏已形成的BF是临床防治CAUTIs的难点和热点。
本研究显示，全部临床分离菌株均对碳青霉烯类抗生素和替加环素敏感，对其余包括左氧氟沙星在内泌尿外科常用抗生素均呈现相对较高的耐药，且50%(23/46)的菌株呈现多重耐药。据美国NHSN报告[8]，2011～2014年CAUTIs相关E.coli临床分离株有10800株，其中35%对氟喹诺酮类药物耐药，16%对第三代头孢菌素类药物耐药。氟喹诺酮类药物对ESBLs E.coli的敏感性较低，是否仍然作为CAUTIs一线药物值得思考。
BF是细菌为了生存，于介质表面以群体的方式包埋于胞外多聚物组成的基质网中，为自己构建了一个功能性的“保护伞系统”。BF是引起CAUTIs致病和致耐药最为重要的原因。导尿管作为医源性的植入物，一方面突破人体正常的生理防御机制增加了致病菌易感机会，另一方面作为异物成为BF的合适载体。BF所提供的保护性微环境与60%～85%的植入物体内病原菌感染有密不可分的关系[9]。
研究BF首先需要构建BF孵育系统。既往的BF研究大多基于体外静态培养基，细菌在静止培养条件下于介质表面形成BF，干预因素也相对简单。然而生物体器官、组织及细胞均处于动态流体微环境中，如CAUTIs相关性BF细菌感染就处于膀胱及尿道的动态尿流环境中。与静置条件培养相比，流加培养条件下全过程营养配给均衡充足，细菌生长代谢水平提高，细菌产物的产量增加。因此，构建更加符合人体膀胱尿流微环境，更好的模拟生理功能状的“动态培养基”成为研究的关键环节。本研究创新性地组建灌流式膀胱细菌BF动态孵育模拟系统，较好地模拟了膀胱内尿液持续平衡流动环境，构建了ESBLs E.coli动态BF模型。本研究发现，ESBLs E.coli绝大多数具备BF形成能力，动态模型BF阳性率及形成能力均高于静态模型，这表明本研究小组自行组建的动态模型较常规的静态模型显著地促进了BF形成，尤其在高BF产生菌株(即BF强阳性亚组)显示了更大的优势。这可能与动态模型提供持续的流体环境，细菌获得适合的孔隙间距，营养物质均衡分布，菌落内水/营养物渗透更有利于BF细菌生长有关[10]。
本研究显示，无论是静态模型，还是动态模型，CAUTIs相关性ESBLs E.coli BF不同表型对抗生素的耐药性均不存在差异。既往研究表明[11]，屎肠球菌临床分离株BF形成能力更强，BF阳性株比阴性株对抗生素有更显著的耐药性，这可能与BF细菌产酶和BF特殊结构“双重”耐药性机制有关。此外，体外实验证实BF细菌能被敏感抗生素清除的浓度，已超出抗生素在体内所能达到的极限值。因此，BF感染的防治策略亟需进一步探索和完善。
实验存在的不足：①动态模型处于初步应用阶段，尚不能完全模拟膀胱内环境。可能的改进措施包括：全系统密闭、避光设计，引入自动化数控模块蠕动泵实现全自动化控制流速、流量，实现模拟膀胱容量变化等。②ESBLs E.coli BF形成能力与BF细菌耐药分子机制等，课题小组将在进一步的实验中探究和完善。
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