吴琼 张振武 王哲银 张娟 赵妍
(深圳市人民医院疼痛科，广东 深圳 518020)
胰腺癌是癌症死亡的重要原因之一，大多数胰腺癌患者在诊断时出现中度至重度疼痛，故疼痛治疗尤为重要。胰腺癌疼痛的原因包括神经鞘和神经节的浸润、导管和间质压力增加以及腺体炎症[1-2]。但胰腺癌疼痛机制尚未完全了解，目前对癌症疼痛的评估和治疗策略尚不充分。T细胞死亡相关基因8(TDAG8)是OGR1家族的一员，被鉴定为一种质子感应G蛋白偶联受体。TDAG8主要在背根神经节(DRG)神经元中表达。越来越多的研究[3]表明TDAG8在疼痛中具有重要作用，如减弱脊髓中TDAG8的表达可抑制骨癌疼痛。另外，TDAG8可以调节神经胶质细胞数量来控制类风湿性关节炎慢性疼痛[4]。然而，目前对TDAG8维持胰腺癌疼痛的功能作用和潜在机制知之甚少。有研究[5-6]表明，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)的激活可导致各种刺激引起的疼痛相关行为，如脑源性神经营养因子(BDNF)和神经损伤。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是AKT下游信号分子，调控转录、翻译起始、核糖体生物合成和凋亡。最近的证据表明mTOR在脊髓和感觉神经元轴突中表达，阻断mTOR可减轻与局部炎症或神经性疼痛相关的疼痛相关行为[7-8]。然而，AKT/mTOR在胰腺癌疼痛中的作用报道鲜少。因此，本研究构建裸鼠移植瘤胰腺癌疼痛模型，通过沉默TDAG8及AKT通路抑制剂LY294002处理模型鼠来探讨TDAG8在胰腺癌疼痛中的作用，进一步为临床试验提供可能帮助。
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂、仪器 人胰腺癌细胞系SW1990细胞(中国科学院ATCC细胞库)；
AKT/mTOR通路抑制剂LY294002(上海碧云天生物公司)；
反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒、苏木素伊红(HE)染色试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司)；
NC-siRNA、TDAG8-siRNA (siRNA链经过化学修饰)(深圳华大基因)；
Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；
TDAG8、降钙素基因相关肽(CGRP)、P物质(SP)、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR抗体(英国Abcam公司)。电子Von Frey测痛仪(美国IITC)；
石蜡切片机(德国Leica公司)；
普通光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；
凝胶成像系统(美国BioRad公司)。
1.1.2 实验动物 5周龄雌性BALB/c裸鼠(19～21 g)48只饲养在温度23℃～25℃、湿度45%～55%的12 h的光/暗循环环境中，食物和水可以随意获得。所有实验得到本院伦理委员会的批准(IACUC202006)。
1.2 方法
1.2.1 构建胰腺癌裸鼠模型 人胰腺癌细胞系SW1990保存在添加10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养，每3天更换一次培养基。BALB/c裸鼠在特定的无病原体环境中适应一周后，用戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉裸鼠，在左侧腰区切开腹部，将胰腺尾部和脾脏暴露出来。用装有26号针的注射器将20 μL SW 1990细胞(5×106)缓慢注入胰腺体内，形成2～3 mm的囊泡。随后将胰腺和脾脏移入腹腔，用手术缝合线缝合切口。所有手术均在超净台中进行。然后，进行药物治疗和疼痛行为。
1.2.2 实验分组及给药 将裸鼠随机分为4组：假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、NC-siRNA组、TDAG8-siRNA组，每组12只。Sham组裸鼠注射相同体积的培养基作为对照。NC-siRNA、TDAG8-siRNA、LY294002组在构建胰腺癌裸鼠模型后分别每天腹腔注射100 μL NC-siRNA、TDAG8-siRNA。同时模型组裸鼠随机分两组，分别腹腔注射AKT/mTOR通路抑制剂LY294002 30 mg/kg (LY294002组)以及相同体积的DMSO溶液(DMSO组)作为对照。
1.2.3 HE染色 裸鼠造模4周后，将Sham组和Model组裸鼠麻醉，随后解剖裸鼠胸腔暴露心脏，生理盐水灌注主动脉，然后用4%多聚甲醛固定。灌注成功后，将胰腺从腹膜脏器分离，置于4%多聚甲醛过夜。将胰腺组织放入不同酒精梯度脱水，二甲苯透明，随后制作石蜡组织块，并切成5 μm的切片。切片经二甲苯和酒精梯度脱蜡、复水。然后根据HE试剂盒说明书进行染色，染色完成后梯度酒精脱水，晾干，用中性树胶封片，在光学显微镜下观察组织切片，拍照保存。
1.2.4 测量体重 分别于造模后1、3、5、7、10、14、21、28 d测量Sham组和Model组裸鼠体重，记录并分析。
1.2.5 驼背评分 将裸鼠单独放置在一个开阔的场地中心，地板上覆盖着干净的无纺布，并对其进行300秒的观察。驼背行为0～4分：0分：正常；
1分：轻度耸起；
2分：严重耸起；
3分：严重驼背，活动减少；
4分：静止不动。观察人员对组别进行盲法，由3名独立人员统计结果。
1.2.6 检测裸鼠腹部机械性痛觉阈值 为了评估裸鼠机械痛觉过敏行为，实验动物提前3 d在试验环境中适应，每天10 min。根据以前报道的方法[10]，采用电子Von Frey仪测量机械痛阈值。将裸鼠置于网状筛网平台顶部的塑料室中，适应10 min。逐渐以越来越大的力刺激裸鼠上腹部区域的皮肤。在刺激过程中的裸鼠出现舔挠腹部或者退缩被认为是阳性反应。记录仪器获得的值为机械痛阈值。试验连续进行5次，计算平均痛阈值(每15 min 进行一次试验)。
1.2.7 实时荧光定量PCR 在手术后的不同时间点处死裸鼠，由于胰腺由来自脊髓T8～12的神经支配，因此使用Trizol试剂从脊髓背角组织中提取总RNA。用PrimeScriptTMRT试剂盒反转录成cDNA。使用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析，并使用β-actin标准化靶基因mRNA的相对表达。引物序列：TDAG8：forward 5′-CAG CAG CAC GGC CTT CCT CAC TT-3′，reverse 5′-CGA CAC TTG TTT CGT CTT CCC AC-3′；
β-actin：forward 5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，reverse 5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。
1.2.8 Western blotting 在手术后的不同时间点处死裸鼠，在冰上取脊髓背角组织于含有10 mM PMSF的RIPA裂解缓冲液中匀浆提取。首先，在10% SDS-PAGE凝胶上分离每孔含20 μg总蛋白的20 μL上样缓冲液，然后转移至PVDF膜。用5%脱脂牛奶在TBST中室温封闭1 h，并与一抗在4℃下孵育过夜。二抗孵育2 h后，使用Bio-Rad紫外成像系统检测印迹信号，Image J软件对免疫印迹进行定量。
2.1 胰腺癌痛裸鼠和正常裸鼠体重变化的比较 Sham组裸鼠术后第8 d开始体重逐渐增加，而Model组裸鼠体重从第8 d逐渐降低，与Sham组比较，Model组裸鼠第10～28 d体重显著降低(P<0.05)，见图1。
图1 各组裸鼠的体重变化
2.2 胰腺癌痛裸鼠和正常裸鼠胰腺组织病理学变化的比较 HE染色结果显示，Sham组裸鼠胰腺组织中腺泡细胞排列整齐，并且观察到规则的胰岛细胞；
Model组裸鼠胰腺中观察到胰腺癌细胞呈条索状排列密集，可见炎性细胞浸润。见图2。
图2 各组裸鼠的胰腺组织HE染色
2.3 胰腺癌痛裸鼠脊髓背角组织中TDAG8的表达 为了揭示疼痛过程的分子机制，通过RT-qPCR和Western blotting 检测胰腺癌痛裸鼠脊髓背角组织中TDAG8的表达，结果显示，与Sham组比较，Model组和NC-siRNA组中TDAG8 mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05)；
与Model组、NC-siRNA组比较，TDAG8-siRNA组的TDAG8 mRNA和蛋白水平显著降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图3。
图3 各组裸鼠脊髓背角组织中TDAG8的表达
2.4 抑制TDAG8对胰腺癌痛裸鼠驼背评分以及机械痛阈值的影响 与Sham组比较，Model组和NC-siRNA组裸鼠从第14～28 d驼背评分显著升高(P<0.05)；
与Model组、NC-siRNA组比较，TDAG8-siRNA组裸鼠第14～28 d评分显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。使用Von Frey纤维测痛仪测量裸鼠腹部机械刺激痛敏反应，结果显示，与Sham组比较，Model组和NC-siRNA组裸鼠在术后第10～28 d腹腔机械痛阈值均显著下降(P<0.05)；
与Model组、NC-siRNA组比较，TDAG8-siRNA组裸鼠第10～28 d腹腔机械痛阈值显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。
图4 各组裸鼠驼背评分以及机械痛阈值的表达
2.5 抑制TDAG8对胰腺癌痛裸鼠中SP、CGRP及AKT/mTOR通路蛋白表达的影响 Western blotting 结果显示，与Sham组比较，Model组和NC-siRNA组SP、CGRP、p-AKT和p-mTOR蛋白水平均显著升高(P<0.05)；
与Model组、NC-siRNA组比较，TDAG8-siRNA组的SP、CGRP、p-AKT和p-mTOR蛋白水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5。
图5 各组裸鼠脊髓背角组织SP、CGRP以及AKT/mTOR通路蛋白的表达
2.6 LY294002对胰腺癌痛裸鼠驼背评分以及机械痛阈值的影响 与DMSO组比较，LY294002组裸鼠第14～28 d驼背评分显著降低，并且逐渐减少(P<0.05)；
裸鼠腹部机械刺激痛敏反应实验结果显示，裸鼠术后第10～28 d腹腔机械痛阈值显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图6。
图6 LY294002对胰腺癌痛裸鼠驼背评分以及机械痛阈值的影响
2.7 LY294002对胰腺癌痛裸鼠中SP、CGRP以及AKT/mTOR通路蛋白表达的影响 Western blotting 结果显示，与DMSO组比较，LY294002组SP、CGRP、p-AKT和p-mTOR蛋白水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图7。
图7 LY294002对胰腺癌痛裸鼠中SP、CGRP以及AKT/mTOR通路蛋白表达的影响
胰腺癌引起的剧烈疼痛严重损害了患者的生活质量，威胁患者的生命。疼痛治疗的药物包括阿片类药物和非阿片类辅助镇痛药物，如非甾体抗炎药物。然而，大多数疼痛治疗不能控制胰腺癌疼痛[9-10]。为了研究人类胰腺癌相关疼痛，本研究通过将人SW 1990细胞移植到BALB/c裸鼠体内，成功地建立了胰腺癌诱导疼痛裸鼠模型，这一模型与韩等[11]之前报道的模型一致。在术后第4周，组织学分析显示，正常裸鼠内分泌细胞排列整齐，胰岛正常。内分泌细胞和胰岛分布在毛细血管周围，用于传递分泌的激素。相比之下，在SW 1990异种移植裸鼠胰腺中发现正常胰腺组织结构被破坏，表明成功构建了胰腺癌痛动物模型。本研究结果显示SW 1990异种移植裸鼠体重明显减轻。癌症患者体重下降是由于疼痛和胃出口梗阻引起的，导致饮食摄入减少。
胰腺癌患者的疼痛很难控制，因为只有当肿瘤高度进展并迅速转移到其他器官时，内脏疼痛才会出现[12]。内脏疼痛导致腹部皮肤机械刺激后疼痛阈值降低，称为机械异常性疼痛[13]。在本研究的动物模型中观察到类似的现象。SW 1990异种移植裸鼠腹部皮肤的机械阈值持续降低，表明在当前模型中，胰腺癌引起的内脏疼痛因肿瘤进展增加而加重。内脏疼痛引起的转导途径和感知与皮肤疼痛不同。腹部器官接受双重外源性神经支配，包括脊髓和迷走神经。躯体性疼痛的定位和特征明确，而内脏性疼痛则呈弥漫性定位不准确。在患者和动物模型中观察到自发的内脏痛行为[14-15]。在本研究中，胰腺癌诱发疼痛裸鼠模型引起显著的驼背行为。降钙素基因相关肽(CGRP)和P物质(SP)是影响疼痛传递的两种重要神经递质，在脊髓损伤大鼠背角中表达上调。有研究[16]表明，P物质和CGRP等神经肽在疼痛产生中起关键作用，抑制CGRP和SP可减轻疼痛。本研究结果显示胰腺癌诱发疼痛裸鼠中CGRP和SP表达升高，与之前研究一致。有研究[17]报道TDAG8在脊髓和背根神经节中表达，支持了TDAG8参与痛觉的可能。近年研究[18-19]发现TDAG8参与炎症性疼痛和骨癌性疼痛。目前鲜少有研究报道TDAG8在胰腺癌疼痛中的表达。本研究发现胰腺癌痛裸鼠脊髓背角组织中TDAG8表达显著升高。此外，TDAG8基因沉默减轻了胰腺癌诱导的机械痛觉过敏和内脏痛引起的驼背评分，并且抑制CGRP和SP的表达，以上结果证实了TDAG8在胰腺癌疼痛中具有重要作用。
AKT-mTOR信号级联参与了一些生理和病理过程，如吗啡耐受、痛觉过敏、血管生成等。既往研究[20]表明，AKT信号通路是神经性疼痛脊髓中枢致敏所必需的。mTOR是AKT通路的下游激酶之一，在疼痛相关的中枢神经系统中被激活，并作为阿片类药物诱导痛觉过敏的有效靶点[21]。AKT/mTOR信号通路与疼痛密切相关外，研究表明，在慢性收缩损伤大鼠模型中，AKT/mTOR通路与慢性神经性疼痛相关[22]。在本研究中发现胰腺癌诱发疼痛裸鼠中AKT/mTOR信号通路相关蛋白磷酸化水平升高，这表明AKT/mTOR信号通路在裸鼠胰腺癌诱发疼痛中被激活。此外，结果还发现TDAG8 siRNA抑制 AKT/mTOR信号通路的激活。LY294002是一种AKT抑制剂，已被广泛用于阻断动物模型中的AKT/mTOR信号通路[23]。为了进一步验证抑制AKT/mTOR信号通路在裸鼠胰腺癌诱发疼痛中的作用，本研究将LY294002腹腔注射到胰腺癌模型裸鼠体内，同时注射等体积的DMSO为对照，随后研究其对机械痛觉过敏及内脏痛行为的影响。结果发现LY294002对胰腺癌痛裸鼠的影响结果与抑制TDAG8表达的结果一致。因此，靶向AKT/mTOR信号通路可能提供了一种通过TDAG8治疗胰腺癌疼痛的策略。
本研究结果提示，TDAG8在胰腺癌疼痛进展中具有重要作用，抑制TDAG8可通过抑制AKT/ mTOR信号通路的激活从而减轻胰腺癌疼痛。靶向TDAG8或其下游信号分子可能有效缓解胰腺癌疼痛，这一研究发现可能在将来为预防、减轻或完全缓解胰腺癌的疼痛治疗方法提供一种新途径。
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