曾昭君，余欣彤，邓成程，黎桃敏，史龙梅，张兰兰，刘燎原*
1广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，佛山 528244；
2湖南一方天江药业有限公司，常德 415000；
3陇西一方制药有限公司，定西 748000
木棉花为木棉科植物木棉Gossampinusmalabarica(DC.) Merr.的干燥花，性凉，归大肠经，具有清热利湿，解毒的功效，常用于泄泻、痢疾、痔疮、出血等病症[1]。木棉花资源丰富，广泛分布于我国云南、海南、广西、广东、台湾等地区，一般于春季花盛开时采收[2]。现代研究表明，木棉花含有丰富的黄酮类、苯丙素类及酚酸类等化合物，其中黄酮类化合物芒果苷、芦丁等在肝损伤、心肌缺血再灌注损伤、肺癌等疾病的治疗方面具有良好疗效；
酚酸类化合物有较强的DPPH自由基清除活性，原儿茶酸在糖尿病方面具有潜在的降血糖作用[3-5]。目前，关于木棉花药材显微鉴别、薄层鉴别、芒果苷含量测定的研究较多，但有关木棉花HPLC指纹图谱及其不同部位的质量差异研究却鲜见报道[6]。
仅从单一化学成分去评价木棉花药材的质量存在一定的局限性，通过中药指纹图谱与化学计量学的有机结合，可整体反映木棉花化学成分的多样性和复杂性，系统表征木棉花不同部位的质量差异。熵权优劣解距离(TOPSIS)法通过对多指标进行合理赋权得到一个综合指标，以距离理想化目标的程度为基准进行综合评价，可有效避免主观因素对木棉花内在质量评价的影响，具有一定的准确性和科学性[7，8]。本研究建立木棉花药材及其不同部位(花瓣、花萼、雄蕊)的HPLC指纹图谱，采用相似度评价、热图聚类分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判别分析方法对木棉花不同部位指纹图谱进行质量评价，并结合熵权TOPSIS法对木棉花不同部位的质量进行综合评分排序，旨在为木棉花药材多指标成分富集部位、资源开发提供数据支持，为其质量控制及临床应用研究奠定基础。
1.1 仪器
Agilent 1290型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；
XP26型百万分之一天平、ME204E型万分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；
Milli-Q Direct型超纯水系统(德国Merck公司)；
KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)。
1.2 材料
原儿茶酸(批号：110809-201906，质量分数：97.7%)、芒果苷(批号：111607-201704，质量分数：98.1%)、芦丁(批号：100080-201811，质量分数：91.7%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；
新绿原酸对照品(批号：wkq18030107，质量分数：≥98%)购自四川省维克奇生物科技有限公司；
乙腈、甲醇为色谱纯(德国Merck公司)；
磷酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；
水为超纯水，其余试剂均为分析纯。15批木棉花药材(编号：Y1～Y15)经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为正品，符合2020年版《中国药典》(一部)木棉花项下要求，产地信息见表1。将每批药材根据不同部位分为三类，得木棉花花瓣(编号：B1～B15)、花萼(编号：E1～E15)、雄蕊(编号：R1～R15)。
表1 15批木棉花样品产地信息
2.1 色谱条件
色谱柱为Waters Xselect HSS T3 Column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；
流动相为乙腈(A)-0.5%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～15 min，5%→10% A；
15～30 min，10%→17% A；
30～40 min，17%→18% A；
40～41 min，18%→5% A；
41～45 min，5% A)；
柱温为25 ℃；
检测波长为230 nm；
流速为1.0 mL/min；
进样量为10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
分别取原儿茶酸、新绿原酸、芒果苷、芦丁对照品适量，精密称定，置5 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为84.80、43.10、41.59、48.51 μg/mL的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取样品粉末(过三号筛)约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)45 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验
取木棉花药材供试品溶液(Y10)，按“2.1”项下色谱条件进样测定6次，以7号色谱峰芒果苷为参照峰(S)，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.03%～0.16%、0.41%～1.27%，表明仪器精密度良好。
2.4.2 重复性试验
取木棉花药材粉末(Y10)6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以7号色谱峰芒果苷为参照峰(S)，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.03%～0.09%、0.51%～2.74%，表明该方法重复性良好。
2.4.3 稳定性试验
取木棉花药材粉末(Y10)适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，以7号色谱峰芒果苷为参照峰(S)，计算得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.12%～0.26%、0.11%～2.33%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.5 HPLC指纹图谱的建立及相似度评价
2.5.1 指纹图谱的建立
取15批木棉花药材及其不同部位样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》，分别以Y1、B1、E1、R1号样品的色谱图为参照图谱，设定时间窗宽度为0.1 min，采用多点校正进行色谱峰匹配，中位数法分别生成相应的对照指纹图谱D、D1、D2、D3。通过与混合对照品溶液色谱图比对，指认了4个成分，其中峰2为原儿茶酸，峰3为新绿原酸，峰7为芒果苷，峰13为芦丁。以7号色谱峰芒果苷为参照峰(S)，15批木棉花药材及其不同部位的HPLC指纹图谱见图1～4。结果表明，不同部位样品HPLC指纹图谱的共有峰数量存在差异，其中3批海南产地木棉花花瓣的峰4、6、7均丢失，其雄蕊的峰4也丢失；
6批云南、1批广西产地木棉花花瓣的峰6丢失，提示木棉花药材不同部位之间化学成分存在一定差异。
图1 15批木棉花药材HPLC指纹图谱及共有对照指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints and common control fingerprints of 15 batches of Gossampim Flos
图2 15批木棉花花瓣HPLC指纹图谱及共有对照指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints and common control fingerprints of 15 batches of petals of Gossampim Flos
图3 15批木棉花花萼HPLC指纹图谱及共有对照指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints and common control fingerprints of 15 batches of calyxs of Gossampim Flos
2.5.2 相似度评价
计算15批木棉花药材不同部位HPLC指纹图谱与各自对照指纹图谱的相似度，结果见表2。不同批次木棉花花萼与相应对照指纹图谱相似度均大于0.998，表明木棉花花萼质量较稳定，各批次间化学成分差异较小。以木棉花药材的对照指纹图谱(D)为参照图谱，计算木棉花药材不同部位对照指纹图谱(D1、D2、D3)的相似度，结果见表3。木棉花药材与花萼的相似度为0.976，提示不同批次木棉花药材与花萼化学成分相似，化学成分整体差异较小；
木棉花药材与花瓣、雄蕊的相似度均较低，提示木棉花药材不同部位的化学成分存在较大差异。
图4 15批木棉花雄蕊HPLC指纹图谱及共有对照指纹图谱Fig.4 HPLC fingerprints and common control fingerprints of 15 batches of stamens of Gossampim Flos
表2 15批木棉花药材不同部位HPLC指纹图谱的相似度结果
表3 对照指纹指纹图谱的相似度结果
2.6 化学模式识别研究
2.6.1 热图聚类分析
以15批木棉花药材不同部位HPLC指纹图谱中各特征峰的单位峰面积为变量，采用对数归一化法，以Educlidean平方距离为度量标准，运用Heml 1.0软件进行热图聚类分析(空白处标记为色谱峰丢失)[7](见图5)。热图分析以一种渐进的蓝红色将结果直观展现出来，其颜色代表归一化后的值，值越高颜色越红，值越低颜色越蓝，用于反映研究对象化学成分的差异变化[9,10]。热图分析结果显示，木棉花药材不同部位的峰7、8、12、13成分含量差异较大，主要表现为花萼的峰7、8颜色偏暖，表明其含量较高；
花瓣的峰12、13颜色偏暖，表明其含量较高；
花萼各特征峰颜色整体比花瓣、雄蕊的偏暖，提示木棉花化学成分主要富集在花萼；
不同批次木棉花药材不同部位各特征峰色差较大，提示木棉花药材的化学成分含量与其产地环境存在相关关系。聚类分析结果显示，15批木棉花药材不同部位呈现一定的聚类特征，主要分为Ⅰ和Ⅱ两类，第Ⅰ类为花瓣和雄蕊，第Ⅱ类为花萼，提示木棉花药材不同部位质量存在显著差异，花瓣和雄蕊的质量一致性更高，花萼是木棉花的主要差异性部位，与热图分析结果一致。
图5 木棉花药材不同部位热图和聚类分析图Fig.5 Heat map and cluster analysis of different parts of Gossampim Flos
2.6.2 主成分分析
以15批木棉花药材不同部位HPLC指纹图谱中各特征峰的单位峰面积为变量，以特征值及累计方差贡献率为依据，采用SPSS 20.0软件进行主成分分析(色谱峰丢失标记为0)[11,12]。KMO值为0.782>0.7，Bartlett检验P<0.01，表明实验数据适合进行主成分分析。以特征值大于1为标准提取到4个主成分，其累计贡献率为91.009%，说明提取的4个主成分是评价木棉花药材不同部位质量的代表性成分。以前2个主成分建立坐标系，得到15批木棉花药材不同部位的主成分得分图(见图6)。木棉花药材的不同部位样品明显分布于2个区域，花瓣与雄蕊聚为一类，花萼单独聚为一类，与聚类分析结果一致。花萼样品分布较分散，提示不同批次、不同产地之间花萼的质量存在一定差异。PCA得分图可区分花萼，但花瓣和雄蕊存在相互重合的情况，没有得到有效的区分，且无法确定差异性成分，故采用OPLS-DA法对样品进行分析[13]。
图6 木棉花药材不同部位主成分得分图Fig.6 Principal component score of different parts of Gossampim Flos
2.6.3 正交偏最小二乘法判别分析
为了进一步筛选对木棉花药材不同部位质量产生影响贡献较大的成分，采用SMICA-P 14.0软件分别对15批木棉花药材不同部位HPLC指纹图谱中的各特征峰的单位峰面积进行OPLS-DA分析[14,15]，木棉花药材不同部位OPLS-DA得分图(见图7)，并生成差异性标记物的变量重要性投影值(VIP)图(见图8)。模型的数据矩阵的模型解释率R2X=0.963，区分参数R2Y=0.937，预测参数Q2=0.912，均大于0.50，表明该数学模型的拟合能力和预测能力较好。可见木棉花药材的不同部位样品均可明显区分，各自聚为一类，提示木棉花药材不同部位差异显著。以VIP值大于1作为标准筛选，贡献率依次由大到小的7个变量为：峰8(VIP=1.23)、芒果苷(VIP=1.22)、峰13(VIP=1.19)、峰6(VIP=1.17)、新绿原酸(VIP=1.07)、峰5(VIP=1.05)、芦丁(VIP=1.03)。提示这些成分是木棉花药材不同部位之间化学成分差异的主要标记物，对其质量差异的影响较大。
图7 木棉花药材不同部位OPLS-DA得分图Fig.7 OPLS-DA scores of different parts of Gossampim Flos
图8 木棉花药材不同部位VIP图Fig.8 VIP diagram of different parts of Gossampim Flos
2.7 熵权TOPSIS法分析
对15批木棉花药材不同部位HPLC指纹图谱中各特征峰的单位峰面积进行熵权TOPSIS法分析，依次建立各样品的初始决策矩阵、标准化决策矩阵，计算得到各项指标的熵值ej=(1.440、1.393、1.361、1.404、1.309、1.265、1.088、1.175、1.382、1.340、1.370、1.339、1.274)；
权重wj=(0.106、0.095、0.087、0.098、0.075、0.064、0.021、0.042、0.092、0.082、0.089、0.082、0.066)。根据加权决策矩阵得到最优方案Zj+=(0.106、0.095、0.087、0.098、0.075、0.064、0.021、0.042、0.092、0.082、0.089、0.082、0.066)，最劣方案Zj-均为0。计算15批木棉花药材不同部位与最优方案的距离(D+)、与最劣方案的距离(D-)及最优解的欧氏贴近度(Ci)，见表4。D+越小、D-越大、Ci越大，则被评价样品越优[16,17]。由表4知，15批花瓣、花萼、雄蕊的Ci平均值分别为0.416、0.485、0.388，提示花萼质量最优，花瓣次之，雄蕊末之。花瓣、花萼、雄蕊排名前三位的分别是B10、B11、B12，E10、E11、E12，R10、R11、R12，其产地均为云南省，提示该产地木棉花的质量整体较优，可作为优良种质资源进一步研究与开发。
表4 15批木棉花药材不同部位质量评价结果
本研究在对色谱条件进行考察时发现，当检测波长为300 nm时，部分黄酮类化合物色谱峰不存在相应的紫外吸收；
当检测波长为255 nm时，各色谱峰响应值相差较大，芒果苷色谱峰响应较高，部分色谱峰吸收较小或丢失；
当检测波长为230 nm时，各色谱峰信号响应值均较高，基线较平稳，故采用230 nm为检测波长。同时，还对不同提取方式(超声、回流)、提取溶媒(甲醇、50%甲醇、70%甲醇)、溶媒用量(15、25、50 mL)和提取时间(30、45、60 min)进行考察，结果发现采用“2.3”项下方法制备的供试品溶液各色谱峰分离度较好、组分含量较高。
研究结果表明，木棉花药材与花萼的相似度较高，花瓣与雄蕊的相似度较为接近。热图聚类分析结果表明，花瓣和雄蕊的质量一致性更高，木棉花化学成分主要富集在花萼，与相似度结果一致。CA和PCA结果显示，二者均可明确表征花萼与花瓣、雄蕊样品之间存在显著差异，花瓣与雄蕊间差异相对较小。结合OPLS-DA分析，可以较好地将木棉花花瓣、花萼、雄蕊完全区分，峰8、芒果苷、峰13、峰6、新绿原酸、峰5、芦丁为三者之间的差异性化合物，可作为区分木棉花药材不同部位的指标性成分。同时结合熵权TOPSIS法，对15批木棉花药材不同部位的各特征峰赋权，根据Ci值对木棉花药材不同部位样品进行排序，能实现对木棉花药材整体控制以及优质种源筛选。研究结果显示，云南省木棉花样品Ci均值均高于其余产地样品，且花萼质量更优。
综上，本研究建立的木棉花药材及其不同部位HPLC指纹图谱检测方法稳定可靠，通过化学模式识别和熵权TOPSIS法，对木棉花药材及其不同部位的HPLC指纹图谱进行分析评价，可全面、综合、系统地对样本进行质量评价和差异分析，从而比较不同部位的化学成分差异，明确化学成分的分布规律，为木棉花药材的质量控制和临床应用提供数据支持。
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