齐和日玛，苏日娜，成日青，塔娜，李慧聪，萨仁高娃（.内蒙古医科大学药学院，呼和浩特000；
2.内蒙古医科大学民族医药创新中心，呼和浩特 000）
紫草为中医和蒙医常用药材，最早记载于《神农本草经》，为紫草科软紫草属植物新疆紫草Arnebia euchroma（Royle）Johnst.和内蒙紫草Arnebia guttataBunge 的干燥根，具有清热凉血、活血解毒、透疹消斑的功效，用于治疗血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤[1]。紫草中含有萘醌类、单萜苯醌、苯酚类、酚酸类以及多糖类多种具有生物活性的成分[2]。多糖是一类非特异性的免疫作用增强化合物，能提高机体的免疫功能，具有抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、降血糖及降血脂等功效，受到了越来越多的研究者的关注。已有研究表明紫草多糖具有多种免疫增强功能，有明显地抑制单纯性疱疹病毒、非特异性抗炎的作用[3-4]。
目前大部分传统中药多糖制剂存在稳定性差、生物利用度低、易被降解及对细胞穿透力弱等缺点，影响了多糖药效的发挥。脂质体是由两亲性的磷脂或其他材料构建的双层囊泡，是重要的纳米载体之一，其结构与生物膜相似。脂质体可提高药物的生物利用度，减少药物的不利影响，同时具有低毒性、缓释作用、改善稳定性等优点[5]。本试验制备了紫草多糖脂质体，优化了其处方工艺，并对该制剂的质量进行了评价，以期提高紫草多糖的生物利用度及治疗效果，降低使用剂量，为紫草多糖新剂型的研发提供依据。
1.1 试药
紫草多糖（自制[6]，纯度大于90%），卵磷脂（上海易恩化学技术有限公司，批号：R005468），胆固醇（上海易恩化学技术有限公司，批号：R008055），葡萄糖对照品（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20120728，供含量测定用），其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
TG16.6 型高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；
N-1300 旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；
BSA124S 型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；
KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
U-1901 紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；
SHB-IV 双A 型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。
2.1 紫草多糖脂质体的制备
采用逆向蒸发法[7]，精密称取适量卵磷脂、胆固醇，溶于10 mL 氯仿，超声使其完全溶解。采用旋转蒸发仪减压蒸发至圆底烧瓶内壁形成一层均匀薄膜，加入10 mL 乙醚将薄膜溶解，加入适量紫草多糖质量浓度为1.5 mg·mL－1的溶液（用pH 为7.4 的硫酸盐缓冲溶液配制），混匀，减压蒸发至乙醚挥发完全，即得紫草多糖脂质体混悬液，4 ℃保存备用。空白脂质体除不加紫草多糖外，其他条件同上。
2.2 检测波长的确定
精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品100 mg，置100 mL 量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，从中吸取10 mL 置100 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，即得0.1 mg·mL－1的对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混匀，加入5 mL 浓硫酸，混匀，沸水浴中加热25 min，取出后冰水浴中冷却5 min。另精密取蒸馏水2 mL，同法操作作为空白对照，200 ～800 nm 进行扫描，结果在485 nm 处出现最大的吸收峰，空白脂质体在此处无吸收，故选择检测波长为485 nm。
2.3 脂质体包封率的测定
2.3.1 标准曲线的绘制 精密量取“2.2”项下的对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 分别置试管中，加蒸馏水至1 mL，再加5%的苯酚溶液1 mL，混匀，加浓硫酸5 mL，摇匀，置于沸水浴25 min，取出放置冰水浴5 min。另精密取蒸馏水2 mL，同法操作作为空白对照，在485 nm 处测定其吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，葡萄糖浓度（c）为横坐标，得回归方程A＝0.0105c－0.1783（R2＝0.9995），结果表明葡萄糖在21.4 ～107.1 μg·mL－1与吸光度线性关系良好。
2.3.2 精密度试验 精密量取同一质量浓度紫草多糖溶液1.0 mL，按上述方法进行显色，在485 nm 处测定其吸光度，平行测定6 次，结果吸光度值RSD为0.12%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验 精密量取同一质量浓度紫草多糖溶液1.0 mL，按上述方法进行显色，分别在0、30、60、90、120、160、180 min 于485 nm处测定吸光度，结果吸光度值RSD为2.0%，表明供试液在显色后的3 h 内稳定性良好。
2.3.4 加样回收试验 精密称取葡萄糖对照品溶液，分别配制成高、中、低（0.10、0.05、0.03 mg·mL－1）3 个不同质量浓度，加入适量空白脂质体，于485 nm 处测定其吸光度值。结果高、中、低质量浓度的平均加样回收率分别为96.38%、95.86%、97.16%，RSD值分别为1.1%、0.29%、0.35%。
2.3.5 包封率的测定 采用超速离心法测定[8]：吸取0.2 mL 脂质体至超速离心管中，以8000 r·min－1超速离心30 min，吸取上清液0.1 mL，在485 nm 处测定其吸光度，计算游离多糖的浓度。另取0.2 mL 脂质体，破乳，测定脂质体中多糖总量，按下式计算包封率（EE）：EE（%）＝（1－cf/ct）×100%，式中cf为游离药物的量，ct为脂质体中药物的总量。
2.4 紫草多糖脂质体处方的单因素考察
2.4.1 药物与卵磷脂比（药脂比）考察 固定处方中胆固醇用量、水相缓冲溶液pH 值、超声时间等，参考相关文献，选取药脂比为1∶2、1∶4、1∶8，1∶10 制备脂质体，测定其包封率、粒度、多分散指数（PDI）及Zeta 电位。结果如表1所示，当药脂比为1∶4 时，所制得的脂质体包封率高、粒径小。
2.4.2 胆固醇与卵磷脂比（膜材比）考察 固定其他条件，选取膜材比分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶10的紫草多糖脂质体，测定其包封率、粒度、PDI 及Zeta 电位。结果如表2 所示，当膜材比为1∶8 时，所制得的脂质体包封率高，粒径小。
表2 膜材比考察Tab 2 Ratio of cholesterol to phospholipid
2.4.3 超声时间考察 固定处方中药量，水相缓冲液pH 值，膜材比，制备不同超声处理时间的脂质体并对其进行表征，结果如表3 所示，超声时间 2 min 制得的脂质体包封率最高。
表3 超声时间考察Tab 3 Ultrasonic time
2.5 正交设计优化紫草多糖脂质体处方
在单因素考察结果的基础上，选择膜材比（A）、药脂比（B）、超声时间（C）3 个影响因素，每个影响因素设3 个水平，以包封率为主要考察指标，进行正交试验。正交试验因素水平设计见表4。选用L9（33）正交表，分别制得紫草多糖脂质体，测定其包封率，结果见表5，方差分析见表6。
表4 正交试验因素水平设计Tab 4 Factor and level
表5 正交试验结果Tab 5 Orthogonal test
表6 方差分析Tab 6 Analysis of variance
根据表中极值（R）直观分析可知，各因素重要程度依次为药脂比（B）＞膜材比（A）＞超声时间（C），考虑到操作简便性，最终确定最佳处方为A2B2C1，即膜材比为1∶8，药脂比为1∶4，超声时间为2 min。
2.6 验证试验及质量评价
按“2.5”项下最优处方制备3 批紫草多糖脂质体，测得包封率分别为80.95%、79.14%、81.76%，制备工艺重复性良好，外观呈均匀褐色的透明混悬液，平均粒径为（131.91±2.38）nm，PDI 为（0.134±0.012），Zeta 电位为（－18.13±0.14）mV，见图1。4℃放置10 d 无沉淀生成，稳定性良好。
图1 紫草多糖脂质体粒径分布和Zeta 电位Fig 1 Particle size distribution and potential of Arnebiae Radix polysaccharide liposomes
2.7 体外释放试验
制备与最优处方相同质量浓度的紫草多糖的PBS 溶液（pH 7.4），取此溶液和紫草多糖脂质体混悬液各5 mL 于处理好的透析袋中，密封，浸入至200 mL pH 7.4 的PBS 释放介质（透析液）中，37℃下100 r·min－1恒温磁力搅拌，分别在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h 吸取1.0 mL 透析液，并立即补加空白释放介质1.0 mL。测定吸光度，计算累积释放率，绘制体外释放曲线。
累积释放率（%）＝一定时间释放的药量/药物总量×100%
由图2 可知，8 h 时紫草多糖溶液组释放率已达82.43%，在12 h 时已基本释放完全；
紫草多糖脂质体释药过程可分为快速释药期和缓慢释药期，在0 ～2 h 释药相对较快，与原料药的释药基本一致，之后释放较溶液组变慢，在6、12 h 时累积释放率分别为57.88%、75.78%，24 h 时为81.46%，表明制备的紫草多糖脂质体有一定的缓释作用[9]。
图2 多糖原药及脂质体累积释放曲线Fig 2 In vitro release curves of Arnebiae Radix polysaccharide liposomes
脂质体的制备方法有注入法、熔融法、薄膜分散法、超声分散法、逆向蒸发法、冷冻干燥法、高压乳匀法等。近年来，逆向蒸发法广泛应用在生物大分子和水溶性药物脂质体的制备，该法所制脂质体包封率高，方法简单、工艺可行[10-11]。本研究采用逆向蒸发法制备了紫草多糖脂质体，其最优处方工艺为膜材比1∶8，药脂比1∶4，超声持续时间2 min，包封率可达（80.62± 1.09）%，平均粒径为（131.91±2.38）nm，PDI 为（0.134±0.012），Zeta电位为（－18.13±0.14）mV，4℃放置10 d 无沉淀生成，说明紫草多糖以脂质体为载体是可行的[12]。体外释药实验结果表明，与紫草多糖溶液相比，紫草多糖脂质体体外累积释放率降低，紫草多糖脂质体有一定的缓释作用。
后续本课题组将继续考察紫草多糖脂质体的活性、生物利用度、稳定性等，并与原药进行比较，对紫草多糖新剂型的研发及利用具有重要意义。
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