韩 冰， 贾永梅*， 李志果， 周国华， 刘培炼， 余 彪， 张玲玲， 薛茗月
(岭南师范学院化学化工学院，广东湛江 524048)
真菌毒素是由霉菌产生的一类次生代谢产物，广泛分布于自然界中，尤其在食品中较为常见。当人类和动物通过食物摄入真菌毒素时，会导致身体功能下降，从而引发各种疾病甚至死亡[1,2]。常见的真菌毒素有赭曲霉毒素A、伏马菌素、黄曲霉毒素、棒曲霉素和玉米赤霉烯酮[3]。其中，黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的一类强毒性次生代谢产物，是自然界中已发现的理化性质最稳定的一类真菌毒素[4]，当人和动物通过饮食摄入黄曲霉毒素后表现出强烈的亲肝性，引起肝脏出血、脂肪变性、胆管增生和肝癌等疾病[5,6]。食品中黄曲霉毒素的污染问题已得到世界各国的关注，食品中黄曲霉毒素含量的检测已成为研究热点课题。在各种黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的毒性最强，污染范围最广，且能够阻止细胞中RNA的合成，在很大程度上增加人类和动物肝硬化、坏死和癌症的风险，已被世界卫生组织的癌症研究机构归类为Ⅰ类致癌物[7 - 9]。目前，常用的AFB1检测方法主要包括两大类：色谱法[10,11]和免疫分析法[12]。高效液相色谱-串联质谱是检测AFB1的强有力工具，然而高昂的仪器配置和使用成本使该方法难以普及[13 - 15]。而免疫分析法如酶联免疫分析、化学发光免疫法和荧光偏振免疫分析法，则受制于检测试剂盒，分析成本昂贵[16 - 19]。
近年来，随着生物技术的发展，一种新的生物分子即核酸适配体在生物传感器中广泛应用。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术在体外筛选得到的一段单链寡核苷酸，能够与小分子、蛋白质、细菌、病毒、细胞等靶标分子特异性地结合[20 - 23]。在分析和诊断领域，与抗体相比，核酸适配体表现出许多优点，如制备简单且易修饰、易合成、易长期保存、特异性识别功能强、稳定性好、生物相容性好等[24,25]。基于上述优点，使得适配体在疾病诊断和治疗、蛋白质组学研究、生物传感和毒素传感、微生物检测等领域得到越来越广泛的应用[26 - 28]。随着核酸适配体的不断改进和组合，快速检测生物毒素技术将更加便携、稳定和高效，具有很大的优势。但是核酸适配体作为一段寡核苷酸片段，自身不具有信号转换功能，它与靶标分子特异性结合过程，不可产生被检测的物理化学信号。因此，需将核酸适配体与靶标分子特异性识别结合过程转为易于被检测的物理化学信号变化的过程。根据信号转换方式的不同，可将适配体生物传感器分为荧光适配体传感器、比色适配体传感器、电化学适配体传感器和表面拉曼散射适配体传感器等。本文对基于以上4种检测信号的核酸适配体生物传感器在AFB1检测方面的应用进行综述。
比色法是一种可不借助于任何设备，通过肉眼即可进行分析检测的方法，具有简单、微型化、肉眼识别即可实现定性或半定量检测等优点[29 - 32]。基于此优点，Wu等利用核酸外切酶Ⅲ的特异性识别DNA双链的功能，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)为颜色输出信号单元，设计了一种免标记且信号放大的比色法传感器，用于检测AFB1[33]。单链DNA在血红素的作用下，可催化TMB/H2O2发生反应，形成TMB+和H2O，并呈现颜色变化。而解离出的DNA1链又可与另外一个HP链结合，参与循环反应，达到信号放大的目的。凭借肉眼观察，可实现3.1×10-10g/L AFB1的定量检测，同时将该方法用于花生等食物样品中时，对靶标分子AFB1的检测具有良好的可靠性。该研究方法利用具有催化功能的DNA分子和过氧化物催化底物发生颜色变化，相比于传统的AFB1检测方法具有检测成本低、环境污染小、检测稳定性好等优点。
磁性材料在富集状态下，具有易于分离的优点，被广泛应用于比色传感器中。Setlem等将链霉亲和素与磁珠修饰在AFB1的核酸适配体上，在引入DNA酶和血红素后，催化H2O2/TMB发生显色反应，通过监测显色反应信号的变化，实现对靶标分子AFB1的定量检测[34]。利用该方法检测靶标分子AFB1，其检测限可达到2.3×10-5g/L，同时将该方法引入食物样品和真菌分泌物检测时，表现出良好的可靠性。该研究方法集分离、富集、抗干扰和信号读出于一体，进一步拓宽了比色传感器在食品安全领域中的应用范围。
金纳米颗粒(AuNPs)具有光吸收特性，在聚集状态和分散状态下，可表现出不同的光学特征，而被应用于比色检测技术中。Lerdsri等利用柠檬酸盐修饰的AuNPs和四羧酸二酰亚胺衍生物(CPP)，开发了一种免标记、比色法检测靶标分子AFB1[35]。利用CPP与AFB1适配体和AFB1/AFB1适配体复合物之间静电作用力的大小，诱导AuNPs聚集，并产生相应溶液颜色变化，通过监测溶液颜色的变化，实现对靶标分子AFB1的定量检测。在该研究方法中AFB1与AFB1适配体特异性结合需要在一定盐浓度的缓冲溶液体系中，而AuNPs的聚集状态和分散状态对溶液的离子强度要求较为苛刻，因此利用该方法检测靶标分子AFB1需严格控制反应溶液的离子强度。此外，该研究方法检测灵敏度低，无法满足其他样品中AFB1的检测需求。
比色传感器检测靶标分子AFB1虽具有较好的响应速度和灵敏度，是目前最具发展为现场快速检测的实用检测传感器。但是目前该类方法在实际检测复杂组分样品时，并未达到实验室检测水平，还需进一步优化检测系统，使其应用于实际食物样品中靶标分子AFB1的检测。
电化学适配体传感器是将适配体分子识别和电化学信号传导相结合，把核酸适配体与靶标分子的生物识别信号转化为电信号，通过监测电流、电位或电阻信号的变化实现对靶标分子分析检测，方法具有分析成本低、特异性好等优点[36,37]。Mo等利用氧化石墨烯(GO)和多孔Al2O3构建的电化学传感平台检测AFB1[38]。通过化学反应，AFB1-核酸适配体修饰在Al2O3纳米孔中，引入GO后，由于AFB1-核酸适配体与GO之间的π-π堆积作用，GO叠放在Al2O3膜表面。当靶标分子AFB1存在时，AFB1与AFB1核酸适配体特异性结合，Al2O3、GO从Al2O3膜的表面脱离，降低纳米孔所带的电荷量，增加[Fe(CN)6]3-的迁移率，进而呈现电流信号的变化，实现1.3×10-7g/L AFB1的高灵敏、高效检测且呈现良好的特异性。但是利用此方法检测靶标分子AFB1时，核酸适配体修饰于Al2O3膜纳米孔中，如何确保核酸适配体均匀修饰于纳米孔中且处于伸展状态，较为关键。此外靶标分子AFB1带有负电荷，当AFB1核酸适配体与靶标分子AFB1结合后，AFB1核酸适配体的空间结构发生变化，并会影响离子的迁移率，产生相应的电流信号变化，对检测信号产生干扰。
传统的电化学法检测靶标分子AFB1均处于室温条件下或37 ℃，而低温条件下检测靶标分子AFB1及AFB1核酸适配体茎环结构中碱基数目对检测稳定性的影响报道较少。Wang等通过调控AFB1核酸适配体折叠形成茎环结构时，茎部份碱基数目，实现在低温条件下，对靶标分子AFB1的定量检测[39]。该方法为实时、在线、快速定量检测靶标分子AFB1提供广阔的应用前景。
Yang等利用血糖仪建立便携式适配体传感器电化学法检测AFB1[40]。3’端标记巯基，5’端标记转化酶的基底DNA通过Au-S键作用组装在Au电极表面，AFB1适配体可与基底DNA杂化，形成DNA双链结构。当有AFB1存在时，AFB1适配体与AFB1特异性结合，与基底DNA杂化形成的双链结构破坏，而当Pb2+酶存在时，Pb2+酶与基底DNA结合形成DNA双链结构，在Pb2+作用下，基底DNA被切成两段，其中标记有转化酶的一段sDNA远离Au电极表面，通常催化蔗糖转化成葡糖，而血糖仪可以最终定量检测转化出的葡萄糖浓度。但是该研究方法操作步骤较为繁琐，且每一步反应不可控，实验重复性较差。
Goud等利用标记有亚甲基蓝(MB)的核酸适配体作为信号识别单元和功能化的氧化石墨烯(FGO)作为信号放大器，开发一种电化学适配体传感器用于检测靶标分子AFB1[41]。但该电化学传感器的组装过程较为复杂，前期AFB1适配体组装于电极表面通常需要耗费大量时间，需开发取向于集成装置的便携式电化学传感器，进一步提高检测的高效性和实用性。
荧光法具有简便、快速、灵敏度高的特点，因此基于荧光信号检测的适配体生物传感器受到科研工作者的广泛关注[42,43]。利用荧光分析法的优点，我们利用四苯乙烯盐(TPE-z)、GO和核酸适配体开发了一种简单、快速和免标记的荧光分析法，用于靶标分子AFB1的定量检测[44](图1A)。AFB1适配体带有负电荷，TPE-z分子带有正电荷，二者可通过静电作用力结合，形成TPE-z/AFB1适配体复合物。GO通过静电作用力和π-π作用力可吸附单链DNA，而对二级结构的DNA不具有吸附功能，同时具有荧光猝灭能力。当有靶标分子AFB1存在时，AFB1与AFB1适配体特异性结合，AFB1适配体折叠成DNA二级结构，此时复合物AFB1/AFB1适配体/TPE-z从GO表面脱吸附，荧光释放。通过监测荧光信号变化，实现2.5×10-7g/L靶标分子AFB1的定量检测，并呈现出较好的选择性。此外，该方法还应用于玉米、牛奶和大米等食物样品中AFB1的定量分析检测。但是GO带有大量的负电荷，与带有正电荷的TPE-z分子可通过静电作用力，形成复合物，同时GO具有荧光猝灭能力，在有靶标分子AFB1存在时，干扰荧光信号释放。
图1 (A)基于TPE-z和GO的免标记荧光分析法检测AFB1[44]；
(B)基于金属有机框架材料UiO-66-NH2的荧光法分析法检测AFB1[45]Fig.1 (A)Scheme of AFB1 detection aptasensor using TPE-z and GO[44];(B)Illustration of AFB1 fluorescent aptasensor based on UiO-66-NH2[45]
近年来，金属有机框架材料由于具有较大的比表面积和较好的物理、化学稳定性，引起人们的关注。我们利用TAMRA适配体和金属有机框架材料UiO-66-NH2开发了一种荧光适配体传感器来检测AFB1的含量[45](图1B)。在没有AFB1的情况下，TAMRA适配体吸附在UiO-66-NH2的表面上，由于荧光染料TAMRA与UiO-66-NH2之间的电子转移过程，TAMRA的荧光被猝灭。引入靶标分子AFB1后，AFB1与TAMRA适配体可通过静电作用力结合，形成二级结构，从UiO-66-NH2表面脱吸附，其荧光信号释放。通过监测荧光信号变化，实现对AFB1的定量检测。利用该方法对AFB1的检测限为3.5×10-7g/L并表现优良的特异性，同时可实现食物如玉米、牛奶和大米等中AFB1的高灵敏、高效检测。因此，本研究方法在食品安全领域中具有较大的应用价值。
目前，利用荧光分析法检测靶标分子AFB1，需要引入荧光基团和猝灭基团或者具有荧光猝灭功能的功能纳米材料，而在引入靶标分子AFB1后，核酸适配体空间结构的变化也可引起荧光信号改变。基于此，Li等利用荧光各向异性的特点和核酸适配体对靶标分子的特异性识别功能，开发了一种荧光分析法检测靶标分子AFB1[46]。在该研究方法中，AFB1核酸适配体标记荧光基团FAM，而与核酸适配体部分片段互补的DNA序列标记空间结构较大的链霉亲和素。通过调控荧光基团FAM与链霉亲和素之间的距离，产生荧光各向异性值的变化，实现对靶标分子AFB1的定量检测，其检测限为1.9×10-8g/L。该检测方法灵敏度高、特异性好，但是检测范围有限，无法满足实际样品中AFB1的检测。
在荧光分析方法中，很多有机荧光材料抗光漂白能力差，发射波峰宽，不利于长时间检测靶标分子AFB1。为了克服这些缺点，Lu等将AFB1适配体标记在功能化的CdZnTe QDs表面，与其互补的序列标记在AuNPs表面，开发了一种荧光分析法检测AFB1的含量[47]。虽然荧光传感器具有检测灵敏度高、选择性好、响应迅速等优点，但是将荧光分析法引入实际样品中检测靶标分子AFB1时仍存在生物样品背景信号干扰，检测灵敏度、精确度和重现性低等缺陷，需进一步优化荧光传感器，使其在食品安全领域中发挥更大的作用。
通过拉曼信号检测的生物传感器具有无需标记、对样品无损、批量化检测且灵敏度高、选择性好和操作方便快捷等优点[48,49]，近年来引起研究者们关注。Zhao等首次实现了对霉菌毒素双检测的超灵敏(SERS)传感器来同时检测赭曲霉毒素A(OTA)和AFB1[50]。以嵌入式Ag@Au纳米颗粒作为信号接收器，在Ag和Au的连接处嵌入4-NTP或4-ATP来制造SERS标签。SERS标签可以从Ag核和Au壳交界处的等离子体耦合中产生稳定和定量的SERS信号。磁纳米颗粒(MNPs)表面修饰有与OTA和AFB1两种适配体互补的探针序列。当不存在OTA和AFB1时，MNPs通过其表面的探针序列与适配体序列的杂交配对捕获拉曼标签，产生拉曼信号；
当存在OTA和AFB1时，适配体与靶分子结合，因而MNPs探针不能通过与适配体序列杂交配对捕获拉曼标签，不产生拉曼信号。通过监测拉曼信号变化，实现对靶标分子的检测。该方法的优势是可同时检测两种靶标分子即OTA和AFB1。
为了提高检测稳定性，Li等构建一种基于DNA纳米嵌和AgNPs的SERS传感器，用于检测靶标分子AFB1[51]。将DNA分子的5’端标记-SH，通过Ag-S键，将DNA标记在AgNPs表面。10条单链DNA和AFB1核酸适配体，通过DNA分子的自组装技术，组装成DNA纳米嵌。当有靶标分子AFB1存在时，AFB1适配体与AFB1特异性结合，DNA纳米嵌结构被破坏，且其中一条DNA链折叠成茎环结构，此时AgNPs彼此距离较近，SERS信号增强。通过监测SERS信号变化，实现对靶标分子AFB1的定量检测。与其他SERS传感器相比，该方法检测灵敏度较高，检测信号稳定，但是该方法需将AFB1适配体修饰于AgNPs表面，操作较为耗时。
He等开发了一种基于磁珠分离技术的SERS传感器检测靶标分子AFB1[52]。该方法中AFB1核酸适配体通过Au-S键，标记在Au-4MBA@AgNSs上，于其互补的序列(cDNA)标记在Fe3O4@AuNFs上。当有靶标分子AFB1存在时，AFB1核酸适配体与AFB1优先特异性结合，再经过磁珠分离以后，标记有互补序列cDNA的Fe3O4@AuNFs被分离，SERS信号减弱。通过检测SERS信号变化，实现对靶标分子AFB1的定量检测，检测限为4.0×10-10g/L。将该方法引入花生油体系中时，呈现良好的可回收性。该方法利用磁性分离手段有效地避免了繁琐复杂的样品前处理过程，可快速分离富集，且SERS信号的重复性相对较好。
SERS做为一种原位无损的灵敏检测手段，尽管该方法在靶标分子AFB1检测中展现出诸多优越性能，并取得较大进展，但多数方面仅限于实验室研究，对灵敏度高、响应迅速、操作简单、商品化的检测AFB1的SERS传感器还需进一步研究。
本文综述了基于核酸适配体的生物/化学传感器在黄曲霉毒素AFB1检测中的应用研究，包括比色法、电化学法、荧光分析法和表面拉曼散射法等。利用比色法传感器检测靶标分子AFB1是目前最具发展为现场快速检测的实用检测传感器，但是目前该类方法相对于电化学法、荧光分析法和SERS法，检测灵敏度较低，且目前该类方法在实际检测复杂组分样品时，并未达到实验室检测水平。利用电化学法传感器检测靶标分子AFB1，具有检测灵敏度高，特异性好等优点，但组装过程较为复杂，前期AFB1适配体组装于电极表面通常需要耗费大量时间，且无法进行活体中AFB1的成像分析。利用荧光法传感器检测靶标分子AFB1，检测灵敏度高、特异性好，响应迅速且易进行活体成像，但是荧光染料的选择较为困难，尤其在进行活体成像时需要克服生物体背景荧光信号干扰。利用表面拉曼散射法检测靶标分子AFB1，灵敏度高、响应迅速、操作简单、仪器尺寸小适合现场分析等优点，但拉曼散射强度易受光学系统参数等因素的影响。
随着科学技术的发展和新型功能纳米材料的出现，在AFB1检测领域中已取得较大突破，但仍存在一些问题，需要进一步探索：(1) 检测的稳定性、可靠性依然有待提高，适配体探针与信号放大相结合的策略有望提高AFB1检测的灵敏度。(2) 探针的再生与重复使用性能有待改善。(3) 目前检测方法一般在均相体系中检测AFB1，如何将检测方法模块化、便携式，令更多的家庭尤其是欠发达地区能实时检测食品或环境中AFB1的含量，需要进一步探索。
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