王朝亮，孙 科，李云龙，毕天祥，乔保平
郑州大学第一附属医院泌尿外科 郑州 450052
由男性因素导致的育龄女性不孕已经成为严重影响婚姻质量的重大社会问题[1]。男性不育症可由解剖或遗传异常、全身或神经系统疾病、感染、创伤、医源性损伤、促性腺激素异常和精子抗体的异常引起，主要表现为无精症[2-3]和精液质量低下[4-7]。提高男性精液质量是治疗男性不育症的关键问题。
T279基因是一个睾丸组织特异性表达基因，前期的研究[8]已经证实T279基因只在雄性小鼠的睾丸组织中表达，在其大脑、甲状腺、肺、心脏、肝脏、胰腺、小肠、骨骼肌等组织中均无表达，提示T279基因很可能在雄性小鼠睾丸组织精子发生过程中起着特异性作用。作者建立了T279基因敲除小鼠模型，采用交配生育实验、HE染色、生育功能和精子形态学分析等技术，对T279基因的功能进行初步探讨。
1.1 主要试剂与仪器RIPA裂解液、PMSF、Trizol试剂购自上海Sigma公司，甲醇、无水乙醇、二甲苯购自南京玉光化工有限公司，苏木精、伊红购自南京美博生物科技有限公司，Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTP购自上海申能博彩生物科技有限公司，小型离心机购自长沙英泰仪器有限公司，倒置显微镜购自上海蔡康光学仪器公司，Nikon奥林巴斯BX51显微镜购自日本尼康公司，CASA精子分析仪购自自然基因科技有限公司，mHTF培养液由南京大学模式动物研究自行配制。
1.2 实验动物与分组SPF级C57BL/6J品系T279基因敲除纯合子小鼠(T279-/-)12只为实验组，体重26～34 g，12～16周龄；
SPF级C57BL/6J品系成年雄性野生型小鼠(T279+/+)12只为对照组，体重23～36 g，12～16周龄。SPF级C57BL/6J品系野生型雌性小鼠48只，体重24～36 g，12～16周龄。实验用小鼠均由南京大学模式动物研究所提供并饲养。
1.3 交配生育实验实验组和对照组雄性小鼠各12只，每只成年雄性小鼠与两只成年野生型雌性小鼠合笼1个月，统计雌性小鼠产仔数目。
1.4 生长发育指标观察交配生育实验结束后测量实验组和对照组小鼠体重并记录数据；
然后切开腹腔，解剖并游离出泌尿生殖系统，观察比较肾脏、输尿管、膀胱、睾丸发育情况，并摘除各组睾丸组织以精密电子天平称重并记录。
1.5 睾丸组织形态观察所取双侧完整睾丸组织以Bouin"s液固定24 h，乙醇梯度脱水、石蜡包埋，5 μm厚切片，给予常规HE染色，显微镜下观察两组小鼠精曲小管内精子发生状况及睾丸支持细胞、间质细胞、管周肌样细胞形态和发育情况。
1.6 精子活力及精子形态观察取出各组小鼠新鲜的附睾组织，置入1.5 mL EP管，加入1 mL mHTF培养液并将附睾组织剪碎至粉末状，37 ℃恒温孵育20 min以释放附睾组织中的精子，利用CASA精子分析仪测定精子密度，显微镜下观察并计算精子活率。精子活率=活动精子数/总精子数×100%。制作精子涂片并水平放置10 min晾干，浸泡固定3 min再次晾干，常规HE染色，PBS冲洗，中性树脂封片，精密高清显微镜拍摄精子形态图，计算精子畸形率[5]。
1.7 统计学处理采用SPSS 21.0分析，实验组和对照组合笼的雌鼠产仔数目、两组小鼠体重及睾丸质量、精子密度、精子活率、精子畸形率的比较采用两独立样本t检验。检验水准α=0.05。
2.1 交配生育实验结果实验组和对照组合笼雌鼠平均每胎产仔数分别为(7.28±1.45)和(6.61±2.79)，差异无统计学意义(t=1.048，P=0.302)。
2.2 两组小鼠泌尿生殖器官生长发育状态比较两组小鼠肾脏、输尿管、膀胱、睾丸、附睾整体形态和大小无明显差异，见图1。两组小鼠体重及睾丸质量比较，差异无统计学意义，见表1。
左：对照组；
右：实验组
表1 两组小鼠体重及睾丸质量比较 g
2.3 两组小鼠睾丸组织形态学比较两组小鼠睾丸精曲小管内均为正常的精子发生状态，各级精子细胞排列有序，可见正常睾丸支持细胞、间质细胞、管周肌样细胞，见图2。
A、C：对照组；
B、D：实验组；
A、B：×200；
C、D：×400
2.4 两组小鼠精子活力和畸形率的比较两组小鼠精子密度和精子活率比较，差异无统计学意义，见表2。
表2 两组小鼠精子密度和精子活率比较
实验组小鼠精子畸形率高于对照组，差异有统计学意义。对照组小鼠的精子头部呈镰刀形，实验组小鼠主要表现为精子头部畸形，见图3。
A:对照组，黑色箭头示正常精子；
B：实验组，红色箭头示畸形精子
睾丸的精子发生是一个复杂有序的精原细胞分裂分化过程，可以分为增生期、减数分裂期、精细胞变态期。由精子细胞变形成为精子的过程通常称为精子形成，也称为精子变态。整个过程需要不同的基因执行不同的功能共同完成[9-10]，其中睾丸特异性基因[11-13]在精子发生过程中起着至关重要的作用。
既往的研究[12]提示了T279基因表达异常有可能导致男性无精症。本研究结果显示实验组小鼠精子畸形率明显升高，但精液质量、精子活率和生育功能并没有受到太大的影响。我们认为这个情况有可能和物种有关。在地球的进化过程中，不同物种所处的自然环境和进化历程存在巨大的差异，由于自然选择的原因，啮齿类动物的生育功能要远远强于灵长类动物。尽管本研究结果显示T279基因缺失对雄性小鼠生育功能无明显影响，但是基因敲除小鼠模型不能完全等同于人类的生理状态，T279基因缺失对灵长类动物生育力造成的损伤可能比对啮齿类动物大。
总之，T279基因可能在雄性小鼠精子发生过程中起调控作用，主要作用于精子形态改变阶段，有助于维持精子头部的正常形态，降低精子畸形率。进一步研究睾丸特异性基因在精子发生过程中的作用将有助于我们更好的深入发现男性不育症的遗传学发病机制，为男性不育症的治疗探索新的途径。
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