李逸飞，周 镯，曹 园，陈玉根，祁乃喜
1 南京中医药大学附属医院/江苏省中医院，南京 210029；
2 南京中医药大学，南京 210023
“肺与大肠相表里”是中医藏象学说的经典理论之一，外邪犯肺累及肠，肠病也会牵连肺，两者在生理和病理上存在双向的联系。肺和肠都是由上皮细胞和固有层组成的黏膜结构，两者共享相同的免疫调节机制[1]。与正常人相比，哮喘患者的肠易激综合征（IBS）发病率更高[2]。而IBS 和炎性肠病（IBD）患者患哮喘病的概率会大大增加；
此外，大部分IBD 患者存在肺炎或肺功能受损现象，而肺内的高气道反应性可能会引起肠道炎症[3]。因此中医在治疗肺肠疾病时，遵循“肺肠同治”的原则。
乌梅是蔷薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果实。《中国药典》2020版述其归肺、大肠经，具有敛肺涩肠的功效，主治肺虚久咳，久泻久痢[4]。药理研究表明[5，6]，乌梅有抗氧化、抗炎、保肝和抗肿瘤等作用，其常与其他药物配伍治疗呼吸道和消化系统的疾病，如哮喘、腹泻等。
网络药理学是以系统生物学理论为基础，融合药理学、生物学和现代计算机技术，对中药成分、作用靶点和作用通路进行全面的可视化分析，从整体性出发探究药物与疾病的作用关系[7]。本研究选择哮喘和腹泻分别代表肺和肠的疾病，基于网络药理学的方法，探究乌梅“敛肺涩肠”功效的作用机制。
1.1 乌梅成分信息收集
利用TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库收集乌梅成分信息，根据成分的药物动力学（ADME）参数进行筛选，筛选条件：口服生物利用度（OB）≥30%和化合物类药性（DL）≥0.18[8]。同时符合以下条件之一的成分也纳入候选：①相关文献报道该成分入血入尿；
②TCMSP 数据库显示该成分与肺、大肠疾病有相关性；
③《中国药典》2020 版的指标性成分。在TCMSP 数据库中PubChem 下载上述选取成分的2D 结构，以SDF 格式保存。同时，获取筛选的有效成分靶点，将靶点信息导入Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据库作统一命名。
1.2 活性成分的靶点预测
登录Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库，导入乌梅活性成分结构，选定物种为“Homo sapiens”，检索成分靶点。整合TCMSP 数据库的靶点信息，去除重复靶点，即得成分-靶点信息。
1.3 成分-靶点图的构建
将乌梅活性成分和预测靶点导入Cytoscape 3.7.0 软件，构建成分-靶点网络图，见图1。
图1 乌梅“成分-预测靶点”网络
1.4 腹泻和支气管哮喘的疾病靶点预测
利用 GeneCards（https://www.genecards.org/）、CTD（https://ctdbase.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库，以“diarrhea”和“asthma”为关键词，检索“腹泻”和“哮喘”的相关靶点。Drugbank（https://go.drugbank.com/）数据库检索哮喘和腹泻一线药物对应的靶点。整合上述靶点信息并去重复，分别得到治疗腹泻和哮喘的靶点。
1.5 筛选核心靶点
利 用 Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平台将成分-靶点、哮喘-靶点和腹泻-靶点三者作交集，得到乌梅治疗哮喘和腹泻的共同潜在靶点，将其导入String（https://string-db.org/）数据库，选择 “multiple proteins “工具限定物种为“homo sapiens”，获得蛋白质相互作用信息，并导入Cytoscape 3.7.0 软件，进行网络拓扑结构分析，以节点degree 值反映靶点大小和颜色，构建蛋白互作网络。
1.6 共有核心靶点的器官定位
利用BioGPS（http://biogps.org/#goto=welcome）数据库对靶点进行定位，以基因表达大于其在各组织中表达中位数（median）为筛选标准，观察各基因在肺和大肠的表达情况。
1.7 网络分析（GO 和KEGG 分析）
将核心靶点导入David（https://david.ncifcrf.gov/）数据库，进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，设定阈值P＜0.05，筛选具有显著性差异的生物过程。利用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/），按P 值大小顺序，选取GO 分析结果前10 条，绘制GO 功能富集分析柱状图，选取KEGG Pathway分析结果前20 条，绘制通路富集分析气泡图。
1.8 分子对接验证
选取Degree 值排名前五的化合物与排名前三的核心靶点进行分子对接分析。利用Openbabel 软件将成分结构转换为mol2 格式，导入Autodock-Tools（v1.5.6）进行加氢、计算电荷、分配电荷、设置可旋转键后保存为“pdbqt”格式。并从PDB（http://www.rcsb.org）数据库中获取靶点蛋白结构，去除水分子及原始配体，导入AutoDockTools 进行加氢、计算电荷、分配电荷、指定原子类型并保存为“pdbqt”格式。运用遗传算法（Genetic Algorithm）进行对接，计算次数设置为30000，对接完成后，根据结合能值（binding energy）做热图，分析结合能大小，使用Py-Mol 软件对每个蛋白得到的最优结合模式绘图。
2.1 化学成分筛选结果
从TCMSP 数据库检索到乌梅成分40 个，根据设置条件进行筛选得到活性成分29 个[9-11]，见表1。
表1 乌梅活性成分
2.2 化学成分靶点预测结果
通过Swiss Target Prediction 服务器虚拟筛选，同时整合TCMSP 数据库的靶点信息，去重复后共得到成分-靶点基因582 个。
2.3 成分-靶点相互作用网络构建与分析
将其导入Cytoscape 3.7.0 软件，构建成分-靶点网络（见图1）。Degree 值越大，节点度越大。Dgree值排名前五的化合物分别是WM13（苦杏仁苷）、WM16（三丙酮胺）、WM6（花生四烯酸甲酯）、WM14（槲皮苷）和WM28（Rhamnocitrin 3-rhamnoside）。
2.4 疾病靶点预测结果
以“Athma”为关键词在GeneCard、CTD、TTD 和Drugbank 数据库检索，共得到哮喘靶点560 个，以“Diarrhea”为关键词，在上述数据库进行检索，共得到腹泻靶点152 个。
2.5 核心靶点筛选结果
利用Venny 工具将成分-靶点、哮喘-靶点和腹泻-靶点三者作交集，得到乌梅治疗哮喘的潜在靶点160 个，治疗腹泻的潜在靶点42 个，以及治疗哮喘和腹泻共同靶点23 个。将23 个靶点数据导入String 数据库，将下载的TSV 文件导入Cytoscape 3.7.0 软件中，以degree 值反映节点大小和颜色，degree 值越大节点越大，色调越深，见图2。
图2 核心靶点相互作用网络图
2.6 核心靶点的器官定位
分别将乌梅治疗哮喘、腹泻及核心靶点导入BioGPS 数据库，观察靶点在肺与大肠内的表达（Bio GPS 定位器官没有大肠，故以定位结肠代替），以基因在肺与大肠内的表达大于其在各组织中表达的中位数为筛选标准。在乌梅治疗哮喘的160 个靶点中，大多靶点在结肠中表达显著（＞中位数），其中LGALS3、PLA2G2A、MYLK、NFKBIA 等靶点在结肠中的表达极为显著（＞3 倍中位数）；
在治疗腹泻的42个靶点中，41 个靶点在肺中的表达显著，其中MYLK、CES1、TGFB1、MPG 等靶点在肺中表达极为显著；
在治疗哮喘和腹泻的23 个共有核心靶点中，一半以上的靶点在肺与结肠中表达显著。将23 个核心靶点在肺和大肠中的表达数据作图，见图3。
图3 核心靶点器官定位热图
2.7 GO 分析和KEGG 分析
将23 个靶点导入到David 平台进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，根据P 值确定142 个GO条目（P＜0.05），其中118 个与生物过程相关，主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控、免疫反应、对药物反应、细胞对脂多糖反应、炎症反应等；
10 个与细胞组成（CC）相关，主要涉及细胞外空间、质膜外侧、细胞外区域、细胞表面、质膜组成部分等；
14 个和分子功能（MF）相关，主要为细胞因子活性、ATPase 活性（与物质跨膜运动有关）、肿瘤坏死因子受体结合、生长因子活性、异种运输ATP 酶活性等。见图4。
图4 核心靶点GO 功能富集分析
利用David 平台进行KEGG 通路富集分析，共富集43 条信号通路（图5 为前20 条通路信息），主要为IBD、结核、百日咳、疟疾、阿米巴病等。
图5 核心靶点KEGG Pathway 富集通路分析
2.8 分子对接验证
将Degree 值排名前五的化合物（苦杏仁苷、三丙酮胺、花生四烯酸甲酯、槲皮苷和Rhamnocitrin 3-rhamnoside）与排名前三的核心靶点TNF（PDB ID：5UUI）、IL-1B（PDB ID：4GAI）和IL-6（PDB ID：1ALU）进行分子对接。一般认为，当分子对接的结合能小于0 时，受体可与配体自发性结合，若结合能≤-5.0 kJ·mol-1，表明配体有较好的活性[12]。分子对接结果显示，苦杏仁苷、三丙酮胺、花生四烯酸甲酯、槲皮苷和Rhamnocitrin 3-rhamnoside 五个化合物与TNF、IL-1β、IL-6 结合能均小于0（见图6），即能与这三个靶点自由结合。利用PyMol 软件对每个蛋白得到的最优结合模式进行绘图，见图7，槲皮苷占据了TNF 由氨基酸残基甘氨酸（GLY）、亮氨酸（LEU）、异亮氨酸（ILE）、丙氨酸（ALA）、天冬酰胺（ASN）、天冬氨酸（ASP）构成的活性腔，其3’-羟基和4’-羟基分别与ASP 形成氢键，5-羟基与GLY形成氢键，糖基的醇羟基分别与LEU、ILE、ALA、ASN 形成氢键；
Rhamnocitrin 3-rhamnoside 的酚羟基分别与IL-1β 的GLY、GLN 和LYS 形成氢键；
苦杏仁苷的腈基和糖基的醇羟基分别与IL-6 的氨基酸残基GLN、丝氨酸（SER）形成氢键。有研究证明，槲皮苷能抑制结肠腺癌细胞Caco-2 单层膜中TNFα 诱导的促炎因子IL-1β、IL-6 的分泌水平和mRNA 表达水平[13]；
苦杏仁苷能降低肺心病大鼠血清中TNF-α 水平[14]，并能下调椎间盘炎性退变细胞模型的IL-1β mRNA 水平[15]。
图6 分子对接结合能热图
图7 乌梅活性成分与靶点蛋白的最佳接合模式
乌梅作为临床常用中药，它与其他中药配伍治疗呼吸道和消化道疾病，如哮喘、溃疡性结肠炎、腹泻等。《本草纲目》述其“敛肺涩肠,治久嗽泻痢”，现代药学研究表明，乌梅所含甾醇类具有胃黏膜保护作用，在抗溃疡方面发挥重要作用，其中β-谷甾醇能促进结肠癌细胞凋亡；
黄酮类化合物具有抗氧化和治疗哮喘的作用；
其含有的有机酸，起到抑菌作用。
本研究通过网络药理学方法，筛选出乌梅治疗腹泻和哮喘的核心成分、核心靶点及通路。化学成分研究表明，苦杏仁苷、三丙酮胺、花生四烯酸甲酯、Rhamnocitrin 3-rhamnoside 和槲皮苷是乌梅发挥药效的潜在关键成分。研究表明，苦杏仁苷通过调节哮喘大鼠白三烯B4（LTB4）、血栓素B2（TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-K-PGF1α）和组胺（HIS）水平发挥止咳平喘的作用[16]；
此外，苦杏仁苷对不同大鼠溃疡模型起治疗作用[17]。李钦等[18]研究发现，槲皮苷能减轻大鼠溃疡性结肠炎的病变程度并降低MDA、MPO 的水平，以发挥抗炎、镇痛的作用。
靶点筛选结果显示，TNF、IL-6、IL1β、CXCL8 等具有较大的度值，提示这些靶点可能是乌梅发挥“敛肺涩肠”的核心靶点。肿瘤坏死因子（TNF）家族主要包括TNF-α 和TNF-β。作为一种促炎性细胞因子，TNF-α 在多种炎性反应中起作用。尽管TNFα 引起哮喘气道炎症的作用机制尚不清楚；
但是能在哮喘患者的呼吸道中检查出TNF-α mRNA 和增加相关蛋白质含量。同时给予哮喘患者TNF-α 能够直接引起呼吸道应激[19]。此外，离子转运体与感染性腹泻的病理生理过程密切相关。在溃疡性结肠炎中，TNF-α 能引起上皮细胞钠离子通道（ENaC）的表达下降。同时，在人类肠上皮细胞中，TNF-α 激活核因子NF-κB，进而通过p65 与DRA（Down-regulated in adenoma）启动子的直接结合降低DRA 的表达[20]。IL-6 由慢性或急性炎症部位产生，研究表明，IL-6的释放能引起呼吸道中缓激肽受体数量的增加，从而引发呼吸道炎症反应[21]。在肠易激综合症患者中，特别是存在腹泻的患者，促炎性因子IL-6 的表达会显著的增加，而IL-1β 也可能是引起肠易激综合症发病的一大诱因[21]。同时，在慢性阻塞性肺疾病、呼吸系统感染和中性粒细胞哮喘的患者的患者中，会出现IL-1β 炎性反应，经研究发现，哮喘患者中性粒细胞气道炎症、疾病严重程度与类固醇抵抗及IL-1β 表达相关[22]。CXCL8 是一种趋化因子，通过两个G 蛋白偶联受体CXCR1 和CXCR2 介导其作用，其编码的蛋白质白细胞介素-8（IL-8）是CXC 趋化因子家族的一员，是炎症反应的主要介质。CXCL8 与哮喘及炎性肠病等炎症疾病的发病机制相关，哮喘患者气道上皮细胞CXCL8 表达增加；
而在胃肠道环境中，炎性应激反应会触发核苷酸的释放而引发组织炎症，并通过激活P2Y6 受体产生CXCL8/IL-8[23]。
在乌梅治疗哮喘和腹泻的23 个共同靶点中，绝大部分的靶点能在肺与结肠中显著表达。其中，LGALS3、PLA2G2A、TGFB1、MYLK 等与炎症反应相关。TGFB1 是炎性因子，它与哮喘免疫性炎症通路相关，而且在与哮喘相关的气道重塑中起到关键作用，在溃疡性结肠等炎性肠病中，TGFB1 的表达增加[24]。MYLK 基因编码的蛋白参与炎症反应，与气道高反应性和哮喘相关的活动有关，也是胃肠道运动所必需的蛋白质[25]。
GO 富集分析提示，乌梅可能通过一氧化氮生物合成中的正调控、免疫反应、炎症反应等生物过程发挥作用。一氧化氮是细胞内递质，有调节细胞功能、参与组织炎症与损伤的作用，是哮喘、溃疡性结肠炎等疾病的重要促炎因子。研究表明，患者呼出的一氧化氮水平与哮喘的临床症状、嗜酸性粒细胞增多症和嗜酸性粒细胞活化标志物相关。在消化道溃疡患者病变黏膜中，NO 浓度与炎症程度正相关[26]。而哮喘和多种炎性肠病均与免疫反应、炎症反应等多种因素相关。KEGG 富集分析揭示，核心基因与多个呼吸道和消化道疾病相关通路高度相关，包括IBD、结核、百日咳、疟疾、阿米巴等通路。以上结果都印证了乌梅“敛肺涩肠”功效的生物学机制。
综上所述，本研究采用网络药理学方法对其潜在活性成分、作用靶点、分子网络以及靶点的器官定位进行了探索性研究，结果显示，乌梅通过多成分、多靶点、多途径的方式发挥“敛肺涩肠”的功效。